血管內皮生長因子A 對缺氧性肺動脈高壓新生大鼠肺血管重塑的影響及其機制研究

曹靜 羅佳媛 吳典 趙倩 李明霞

（1.新疆醫科大學第一附屬醫院新生兒科，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫科大學兒科學院，新疆烏魯木齊 830054）

新生兒缺氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension, HPH）是新生兒期缺氧性疾病誘發的急危重癥，早期表現為肺血管痙攣，擴血管等對癥治療有效；晚期可導致不可逆性肺血管重塑、右心室肥厚甚至功能衰竭[1-3]，病死率高，因此延緩或扭轉肺血管重塑是該病救治成功的關鍵。成人HPH 研究發現肺血管內皮細胞損傷是該病的起始環節，而該細胞穩態破壞是導致肺血管重塑的關鍵因素[4-5]。血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGF-A）是調控血管內皮細胞功能的重要因子，其通過保護肺血管內皮細胞功能抑制了肺血管重塑進程[6-7]。生存素（survivin, SVV）是一種重要的抗凋亡蛋白，有研究發現VEGF-A 激活蛋白激酶B/鼠雙微基因2 等信號通路上調SVV 表達，抑制了半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的活性，阻斷了細胞凋亡，維持了細胞穩態[8-9]。而在新生兒HPH 發病機制中VEGF-A能否通過調控SVV 保護肺血管內皮細胞進而抑制肺血管重塑進程不清楚。本研究通過建立HPH新生大鼠模型、腺病毒基因轉染等手段深入研究VEGF-A、SVV 在新生大鼠HPH 肺血管重塑中的作用，為阻斷或逆轉新生兒HPH 肺血管重塑提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及儀器試劑

96 只健康清潔級Wistar 新生大鼠，日齡7～10 d，體重20～30 g，由新疆醫科大學實驗動物學實驗室提供。

BL-420S 生物機能實驗系統由成都泰盟科技有限公司提供；Y-MS-51 氧濃度控制系統（主要包括氧濃度控制器和常壓低氧艙）由上海玉研科學儀器有限公司提供；攜帶和不攜帶VEGF-A基因的腺病毒載體（均標記增強型綠色熒光蛋白）由上海吉凱基因公司提供；VEGF-A 及SVV 單克隆抗體均由英國Abcam 公司提供。

1.2 新生大鼠分組及氣管內轉染腺病毒載體

新生大鼠隨機分為HPH+VEGF-A 組、HPH組和對照組，各組根據觀察時間點隨機分為3、7、10、14 d 亞組，每個亞組均為8 只大鼠。給予各組新生大鼠腹腔內注射100 mg/kg 氯胺酮和10 mg/kg 甲苯噻嗪麻醉后，經上門齒懸掛固定，LED 冷光源照射頸部，向左側外上方拉出舌體，充分暴露聲門，氣管導管插入聲門并固定，插入深度約為上門齒與喉部的體表距離；將攜帶/不攜帶VEGF-A基因的2×108PFU 腺病毒原液稀釋至0.025 mL，分別注入HPH+VEGF-A 組和HPH 組新生大鼠氣管內，對照組氣管內注射等量的0.9%NaCl溶液；隨后大鼠取仰臥位，連接小動物呼吸機，呼 吸 頻 率90～100 次/min，潮 氣 量4～6 mL/kg；清醒后拔除氣管導管、撤離呼吸機，24 h 后建立HPH 模型。

1.3 新生大鼠HPH 模型建立

HPH+VEGF-A 組和HPH 組新生大鼠按照成年大鼠[10-11]及本課題組前期造模方法[12-13]建立HPH模型。新生大鼠連同母鼠放入常壓低氧艙，艙內輸入氮氣和氧氣，維持氧濃度（10.0±0.5）%，溫度22～25℃，濕度60%～70%，每天缺氧8 h，晝夜比12 : 12。對照組不給予缺氧干預，飼養條件如上。新生大鼠因缺氧不耐受、氣管插管及合并肺部感染等原因，共死亡14 只，實驗過程中已補充新生大鼠以滿足樣本量要求。

1.4 檢測新生大鼠平均右心室收縮壓

通過直接測壓法測定新生大鼠平均右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure, RVSP）代表平均肺動脈壓力[11,14]。新生大鼠常規麻醉，取仰臥位并固定，行氣管切開、插管，連接小動物呼吸機，打開胸腔，暴露心臟，4.5 號頭皮針遠端連接壓力感受器及BL-420S 生物機能實驗系統，針頭刺入右心室心尖部，記錄平均RVSP。

1.5 檢測攜帶VEGF-A 的腺病毒載體在新生大鼠肺組織中的轉染情況

HPH+VEGF-A 組的不同時間亞組及對照組3 d 的新生大鼠測量平均RVSP 后處死，留取右肺中葉組織，常規制作冰凍切片，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察腺病毒標記的增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）表達情況，Image-Pro Plus 軟件分析積分光密度（IOD）與面積（Area）的比值（IOD/Area），代表EGFP的熒光強度，用以評價腺病毒在肺組織中的定位效果。

1.6 光學顯微鏡下觀察肺血管形態并檢測肺血管重塑指標

各組新生大鼠測量平均RVSP 后留取左肺組織標本，常規制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察肺小動脈形態，利用Image-Pro Plus 軟件計算肺血管重塑指標：肺小動脈中層血管壁厚度（MT）占肺小動脈外徑（ED）的百分比（MT%）和肺小動脈中層橫截面積（MA）占總橫截面積（TAA）的百分比（MA%）。

1.7 免疫組化法檢測肺組織中VEGF-A 和SVV的表達水平

石蠟切片經過脫蠟、脫水、修復、冷卻、沖洗后，5%羊血清室溫封閉30 min，一抗孵育（VEGF-A單克隆抗體，稀釋度1 : 1 000；SVV 單克隆抗體，稀釋度1 : 300），4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，在光學顯微鏡下觀察并采集圖像，肺血管內皮處棕黃色顆粒為目的蛋白的陽性表達，Image-Pro Plus軟件檢測平均光密度值（IOD/Area）代表目的蛋白的表達水平。

1.8 統計學分析

應用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s,）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點各組新生大鼠平均RVSP 比較

缺氧3、7、10、14 d 時，HPH 組平均RVSP明顯高于同日齡對照組和HPH+VEGF-A 組（P＜0.05），表示成功建立了新生大鼠HPH 模型；缺氧3 d 時，HPH+VEGF-A 組與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；缺氧7、10、14 d 時，HPH+VEGF-A 組平均RVSP 高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組新生大鼠平均RVSP 比較 （±s,，mm Hg）

表1 各組新生大鼠平均RVSP 比較 （±s,，mm Hg）

注：[RVSP] 右心室收縮壓。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對照組 8 17.5±0.5 18.3±1.2 19.7±0.7 21.8±1.4 HPH 組 8 22.1±1.4a 23.1±0.9a 24.2±1.2a 27.2±1.1a HPH+VEGF-A 組 8 19.6±1.0b 20.2±0.7a,b 21.7±0.8a,b 24.3±1.0a,b F 值 25.41 17.73 33.22 25.22 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 攜帶VEGF-A 的腺病毒載體轉染新生大鼠肺組織的定位效果

在缺氧3、7、10 d 時，HPH+VEGF-A 組新生大鼠肺組織可觀察到EGFP 的綠色熒光，隨著觀察時間延長熒光強度逐漸衰減，缺氧14 d 時僅可見微弱的綠色熒光；對照組3 d 時肺組織中幾乎看不到綠色熒光（圖1）。對照組3 d 及HPH+VEGF-A組各時間點EGFP 綠色熒光強度比較結果與上述情況一致，見表2。

圖1 攜帶VEGF-A 的腺病毒載體在新生大鼠肺組織的定位效果（激光共聚焦熒光顯微鏡，×200） 對照組3 d 時肺組織中幾乎看不到綠色熒光；HPH+VEGF-A 組在缺氧3 d 時可見明顯的綠色熒光，隨著缺氧時間延長，肺組織內熒光強度逐漸減弱，于缺氧14 d 時綠色熒光不明顯。

表2 各組新生大鼠肺組織熒光強度比較 （±s,）

表2 各組新生大鼠肺組織熒光強度比較 （±s,）

注：a 示與對照組3 d 時比較，P＜0.05；b 示與HPH+VEGF-A組3 d 時 比 較，P＜0.05；c 示 與HPH+VEGF-A 組7 d 時 比 較，P＜0.05；d 示與HPH+VEGF-A 組10 d 時比較，P＜0.05。

組別 n IOD/Area對照組3 d 8 0.005±0.002 HPH+ VEGF-A 組3 d 8 0.057±0.014a 7 d 8 0.047±0.006a 10 d 8 0.040±0.005a,b 14 d 8 0.019±0.008b,c,d F 值 19.129 P 值 ＜0.001

2.3 不同觀察時間點各組肺血管形態學變化

對照組肺小動脈管壁較薄，厚度均勻，內皮細胞排列清晰，中層平滑肌未見明顯增厚；HPH 組從缺氧7 d 可見肺小動脈管壁增厚，局部中層平滑肌增厚，隨缺氧時間延長有加重趨勢；HPH+VEGF-A 組從缺氧10 d 可見肺小動脈管壁厚度不均勻增加，并隨缺氧時間延長有加重趨勢。見圖2。

2.4 不同時間點各組肺血管重塑指標MT%和MA%的變化

缺氧3 d 時，各組MT%和MA%比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；缺氧7 d 時，HPH組MT%和MA%高于對照組和HPH+VEGF-A 組（P＜0.05），HPH+VEGF-A 組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；缺氧10 d 和14 d 時，HPH 組及HPH+VEGF-A 組MT%和MA%均高于對照組（P＜0.05），該兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3～4。

2.5 不同觀察時間點各組肺組織VEGF-A 及SVV表達的變化

免疫組化結果顯示，對照組VEGF-A 在肺血管內皮部位棕色陽性表達少，缺氧各時間點HPH組和HPH+VEGF-A 組VEGF-A 陽性表達較對照組增加，VEGF-A 蛋白表達量均明顯高于對照組（P＜0.05）；缺氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組肺血管內皮部位VEGF-A 陽性表達強于HPH 組，VEGF-A 蛋白表達量同樣高于HPH 組（P＜0.05）；缺 氧10 d 和14 d，HPH 組 與HPH+VEGF-A 組 之間VEGF-A 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3 和表5。

缺氧3 d、7 d 和10 d，HPH 組和對照組SVV在肺血管內皮部位棕色陽性表達差異不明顯，SVV蛋白表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）；缺氧14 d，HPH 組SVV 陽性表達強于對照組，其蛋白表達量也高于對照組（P＜0.05）。缺氧各時間點HPH+VEGF-A 組SVV 在肺血管內皮部位陽性表達較對照組增加，其蛋白定量結果也高于對照組（P＜0.05）；缺 氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組SVV 陽性表達強于HPH 組，其蛋白定量結果同樣高于HPH 組（P＜0.05）；缺氧10 d 和14 d，HPH組與HPH+VEGF-A 組之間SVV 表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4 和表6。

圖2 各組新生大鼠肺血管病理變化（蘇木精-伊紅染色，×200） 對照組新生大鼠肺小動脈管壁薄、厚度均勻；HPH 組和HPH+VEGF-A 組新生大鼠分別從缺氧7 d、10 d 開始可見肺小動脈管壁不均勻增厚，隨缺氧時間延長管壁增厚更明顯。箭頭指示部位為肺小動脈。

表3 各組新生大鼠MT%比較 （±s,，%）

表3 各組新生大鼠MT%比較 （±s,，%）

注：[MT%]肺小動脈中層血管壁厚度占肺小動脈外徑百分比。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對照組 8 44±8 47±6 49±6 52±5 HPH 組 8 45±8 58±7a 63±5a 67±6a HPH+VEGF-A 組 8 45±6 49±7b 56±5a 62±6a F 值 0.06 5.67 12.81 13.80 P 值 0.94 0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 各組新生大鼠MA%比較 （±s,，%）

表4 各組新生大鼠MA%比較 （±s,，%）

注：[MA%]肺小動脈中層橫截面積占總橫截面積百分比。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對照組 8 55±5 55±5 59±4 60±7 HPH 組 8 56±7 64±5a 69±5a 71±5a HPH+VEGF-A 組 8 53±7 58±4b 66±5a 70±5a F 值 0.43 7.32 10.65 8.69 P 值 0.66 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖3 各組新生大鼠肺組織中VEGF-A 蛋白表達（免疫組化，×200） 對照組VEGF-A 在肺血管內皮部位陽性表達少，缺氧各時間點HPH 組和HPH+VEGF-A 組VEGF-A 在肺血管內皮部位陽性表達較對照組增加；缺氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組肺血管內皮部位VEGF-A 陽性表達強于HPH 組，缺氧10 d 和14 d，HPH 組與HPH+VEGF-A 組之間VEGF-A陽性表達差異不明顯。箭頭所指為肺血管內皮部位VEGF-A 陽性表達呈棕色。

表5 各組新生大鼠肺組織中VEGF-A 表達比較 （±s,，IOD/Area）

表5 各組新生大鼠肺組織中VEGF-A 表達比較 （±s,，IOD/Area）

注：[VEGF-A]血管內皮生長因子A。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對照組 8 0.086±0.015 0.122±0.003 0.154±0.003 0.134±0.025 HPH 組 8 0.130±0.001a 0.159±0.031a 0.174±0.005a 0.180±0.020a HPH+VEGF-A 組 8 0.193±0.016a,b 0.195±0.022a,b 0.181±0.001a 0.181±0.007a F 值 53.630 11.113 55.538 17.938 P 值 ＜0.001 0.001 ＜0.001 0.001

圖4 各組新生大鼠肺組織中SVV 蛋白表達（免疫組化，×200） 缺氧14 d，HPH 組新生大鼠肺血管內皮部位SVV 表達較對照組增加；缺氧3 d、7 d 和10 d，對照組與HPH 組SVV 陽性表達無明顯差異。缺氧各時間點，HPH+VEGF-A組SVV 陽性表達多于對照組；缺氧3 d 和7 d，HPH+VEGF-A 組SVV 陽性表達較HPH 組增加；缺氧10 d 和14 d HPH 組和HPH+VEGF-A 組SVV 陽性表達差異不明顯。箭頭所指為肺血管內皮部位SVV 陽性表達呈棕色。

表6 各組新生大鼠肺組織中SVV 表達比較 （±s,，IOD/Area）

表6 各組新生大鼠肺組織中SVV 表達比較 （±s,，IOD/Area）

注：[SVV]生存素。a 示與對照組比較，P＜0.05；b 示與HPH 組比較，P＜0.05。

組別 n 3 d 7 d 10 d 14 d對照組 8 0.161±0.027 0.148±0.052 0.141±0.052 0.151±0.025 HPH 組 8 0.156±0.029 0.160±0.042 0.185±0.031 0.210±0.034a HPH+VEGF-A 組 8 0.304±0.050a,b 0.278±0.045a,b 0.233±0.035a 0.229±0.031a F 值 26.000 15.700 6.458 8.992 P 值 ＜0.001 ＜0.001 0.013 0.004

3 討論

新生兒HPH 在新生兒期并不少見，隨著一氧化氮吸入等技術的應用，提高了該病在肺血管痙攣期的救治成功率，然而在肺血管重塑期，迄今仍無有效的治療方法[3]。成人HPH 研究發現VEGF-A 通過保護肺血管內皮功能抑制了HPH 肺血管重塑[6,15]，另有研究表明VEGF-A 通過調控SVV 表達對血管內皮細胞起到了保護效果[16]。本研究通過氣管內轉染攜帶VEGF-A的腺病毒載體提高了HPH 新生大鼠肺組織中VEGF-A 的表達，上調了肺組織中SVV 的水平，降低了肺血管重塑，在該病發病機制中發揮了保護性作用。

本研究發現，HPH 新生大鼠肺組織中VEGF-A 水平高于對照組，且隨著缺氧時間延長呈上升趨勢，說明VEGF-A 在新生大鼠HPH 發病機制中可能發揮了重要作用。進一步通過氣管內轉染攜帶VEGF-A的腺病毒載體，發現標記EGFP 的腺病毒載體能夠定位到肺組織，并隨時間延長綠色熒光逐漸變弱，提示腺病毒量逐漸衰減。另外免疫組化結果顯示，缺氧3 d、7 d，HPH+VEGF-A 組VEGF-A 表達高于HPH 組，表明外源性VEGF-A 轉染成功。但在缺氧10 d、14 d，HPH+VEGF-A 組VEGF-A 表達與HPH 組比較差異無統計學意義，提示隨著肺組織內腺病毒的衰減，外源性VEGF-A 也呈降低趨勢。

VEGF 是血管內皮細胞的專用肽絲裂原，其家族成員VEGF-A是調節血管功能的最關鍵因子[17-18]。VEGF-A 能夠與血管內皮細胞上的酪氨酸蛋白激酶受體結合，發揮促進細胞存活、新生血管形成、血管擴張等功能。成人HPH 研究發現VEGF-A 可能通過保護肺血管內皮細胞阻礙了HPH 疾病進程[15]，而應用VEGF-A 受體阻斷劑SU5416 聯合慢性缺氧可能造成內皮細胞存活信號喪失、凋亡增加，隨之抗凋亡細胞異常增加，血管閉塞，引發嚴重的肺血管重塑[19]。本研究發現在缺氧各時間點，HPH+VEGF-A 組平均RVSP 低于HPH 組，而自缺氧7 d 開始高于對照組。由于機體在無右心阻塞性疾病情況下，平均RVSP 反映了平均肺動脈壓力水平，因而該結果表明肺組織中VEGF-A高表達能夠降低HPH 新生大鼠肺動脈壓力。由于隨著缺氧時間延長外源性VEGF-A 有衰減趨勢，故HPH+VEGF-A 組平均RVSP 高于對照組，因此有必要進一步探討VEGF-A 的治療策略，使肺動脈壓力接近正常水平。本研究也發現，雖然缺 氧10 d、14 d，HPH+VEGF-A 組VEGF-A 水 平與HPH 組比較差異不明顯，但平均RVSP 仍低于HPH 組，推測其原因可能為：在缺氧早期，肺組織中過表達的VEGF-A 通過抑制肺血管內皮細胞凋亡、擴張肺血管等作用抑制了肺血管痙攣，降低了肺動脈壓力，后期雖然VEGF-A 有衰減，但仍通過早期對肺血管的保護作用降低了肺動脈壓力。此外，在肺血管重塑方面，缺氧7 d，HPH 組新生大鼠出現了肺血管重塑，且隨著缺氧時間延長，肺血管重塑逐漸加重，而HPH+VEGF-A 組在缺氧10 d 發生肺血管重塑，且程度低于HPH 組，進一步說明肺組織過表達VEGF-A 可能通過在缺氧早期保護肺血管內皮細胞功能，延緩了肺血管重塑，也因此進一步降低了肺動脈壓力。

SVV 是凋亡抑制蛋白家族最小的成員，在成年人正常分化的細胞中幾乎不表達，但在生長發育或增殖的細胞（如胚胎、腫瘤細胞等）中廣泛表達[20]。由于新生大鼠處于生長發育期，因此本研究發現SVV 在對照組新生大鼠肺組織中有一定表達。SVV 存在于細胞質、細胞核和線粒體中，在線粒體內/外途徑通過抑制Caspase3、7 和9 而阻斷細胞凋亡，另外SVV 作為染色體乘客復合物家族的一部分，在有絲分裂過程中起著調節染色單體分離、微管穩定性的作用[21]。有研究發現，VEGF-A 誘導SVV 表達通過抑制腫瘤細胞凋亡及穩定微管網絡而降低了化療藥物的作用，促進了腫瘤細胞存活和增殖[22]。而VEGF-A 缺失則通過下調SVV 促進凋亡因子Caspase3、Bax 等釋放，增加了化療藥物的促凋亡作用[16]。本研究在缺氧3 d、7 d 時，HPH+VEGF-A 組SVV 表達高于對照組和HPH 組，缺氧10 d 和14 d 僅高于對照組，說明HPH 新生大鼠肺組織中VEGF-A 過表達促進了SVV 表達升高，而隨著VEGF-A 降低，SVV 也呈下降趨勢。結合上述VEGF-A 過表達降低了肺血管重塑、肺動脈壓力，推測在缺氧早期VEGF-A上調SVV 可能發揮了抑制血管細胞凋亡、促進其存活、維持血管內皮完整性的作用，從而延緩了肺血管重塑，降低了肺動脈壓力。但隨著外源性VEGF-A 逐漸衰減，SVV 也呈降低趨勢，肺血管穩態破壞，于缺氧10 d 肺血管重塑發生，而此時SVV 表達仍高于正常大鼠，提示在肺血管重塑期SVV 可能發揮了促血管細胞增殖的作用。此外，本研究也發現缺氧3 d、7 d 時，HPH 組SVV 表達與對照組無明顯差異，缺氧10 d 其表達呈升高趨勢，缺氧14 d 明顯高于對照組，說明缺氧誘導SVV 升高落后于VEGF-A，可能原因為正常新生大鼠處于生長發育階段，SVV 表達升高，但缺氧影響了新生大鼠的生長發育，可能干擾了SVV 的表達，因此在缺氧早期，即使VEGF-A 表達升高，也并未誘導SVV 上升；而進展至肺血管重塑階段，血管細胞異常增殖，SVV 表達也隨之上升。上述VEGF-A 調控SVV 對肺血管重塑的影響仍需從細胞水平進一步探討該途徑對肺血管細胞尤其是內皮細胞凋亡及增殖的作用。

總之，缺氧早期HPH 新生大鼠肺組織內過表達VEGF-A 促進了SVV 的表達，延緩了肺血管重塑進程，降低了肺動脈壓力，在新生大鼠HPH 發病過程中發揮了重要的保護作用，為新生兒HPH肺血管重塑的靶向干預提供了參考依據。