超高壓殺菌對液態雞蛋微生物和理化特性影響研究進展

張根生，孫維寶，岳曉霞，呂云雄

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150028）

雞蛋含有人體營養所需的所有氨基酸，也是水溶性和脂溶性維生素的來源[1]。液態雞蛋屬于蛋制品，指的是鮮雞蛋去殼后的包含雞蛋清和雞蛋黃的液體狀雞蛋，具有便于運輸、儲存和加工利用的優點。由于液態雞蛋失去了蛋殼和膜的保護，并且蛋清和蛋黃混合后抑制溶菌酶活性，減少了雞蛋自身抑菌能力，使得液態雞蛋更易受微生物污染。此外液態雞蛋富含多種營養成分，會促進腐敗和致病微生物生長繁殖[2-3]。從液態雞蛋中檢出的微生物有：腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhymurium）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、李斯特菌（Listeria）和葡萄球菌（Staphylococcus）等[4-8]。食品企業多采用巴氏殺菌法來殺滅液態雞蛋中的有害微生物，但這一熱加工技術會對其品質產生負面影響[9]，并且一些耐熱微生物在熱殺菌后仍可以存活[10]。

超高壓屬于非熱殺菌技術，通常以水為傳壓介質，使用100～1000 MPa的高壓，對柔性材料密封包裝的食品進行加壓殺菌[11-12]。現有資料普遍認為超高壓主要通過破壞細胞膜細胞壁[13]、破壞蛋白質穩態[14]、影響酶活[15]、影響遺傳機制[16]和改變細胞形態[17]來殺滅食品中的有害微生物。該技術一方面能夠在-5～50 ℃下有效殺大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌等常見有害微生物，滿足微生物限量要求，并延長保質期。另一方面，高壓不會改變共價鍵，對食品質量的關鍵成分破壞性較小；不會使熱不穩定營養素（維生素）變質；不會改變低分子量化合物（風味化合物）[18]。此外，高壓條件還不利于美拉德反應或酶促褐變[19]。因此經超高壓殺菌后的食品，其感官品質和營養特性僅會略有改變。

目前，學者們做了大量液態雞蛋超高壓殺菌保鮮的研究，本文綜述了超高壓技術對液態雞蛋中微生物的殺滅效果，對液態雞蛋理化特性和功能特性影響的研究現狀，分析了目前存在的問題并提出了對策。

1 超高壓對液態雞蛋微生物的影響

1.1 超高壓對液態雞蛋中菌落總數的影響

近幾年，關于超高壓對液態雞蛋中菌落總數影響的研究方法可分為未建立和建立染菌模型兩類。未建立染菌模型，即未人為添加微生物，菌落總數為液態雞蛋中原有微生物數。夏遠景等[20]對液態雞蛋進行超高壓殺菌后發現，致死率隨壓力和保壓時間的增加而增加，pH為6.4時，400 MPa保壓20 min可將菌落總數降至符合國標要求的水平；馬先紅[21]發現300 MPa保壓5 min后，菌落總數減少了約4.5個數量級，也能達到國標要求的水平；類似的，蘇婭等[22]發現300 MPa保壓15 min可將菌落總數降低至符合國標要求；Tóth等[23]研究發現200～250 MPa保壓5 min后將菌落總數降低1～3 lg CFU/mL；白潔等[24]發現在更低的壓力條件下，200 MPa保壓10 min即可將菌落總數控制在國標要求范圍內。這些研究得出的結論初步證明了超高壓殺菌的有效性。但受雞場衛生條件和運輸環境衛生條件影響，不同鮮雞蛋的染菌程度不同，所以上述研究得出的殺菌條件出入較大。

有學者通過建立染菌模型來解決這一問題。建立染菌模型指的是人為刻意添加一定數量的微生物，使液態雞蛋中菌落總數達到較高水平（多為超過國標），以此評價超高壓殺菌效果。楊瑞香[25]通過建立染菌模型（染菌數為簡單隨機抽樣獲取的50枚鮮雞蛋的平均菌落總數），發現300 MPa保壓15 min后菌落總數由4×104CFU/mL降至12 CFU/mL。Nemeth等[26-27]建立高染菌模型（菌落總數為108CFU/mL），發現200～400 MPa保壓3～14 min后，菌落總數顯著減少，最低約為100 CFU/mL；張根生等[28]也建立了高染菌模型（菌落總數為106CFU/mL），發現300 MPa保壓7.5 min后，菌落總數達到國標微生物限量要求。更進一步地，還有學者借鑒柵欄技術，將超高壓協同其他殺菌技術或條件對液態雞蛋進行殺菌。如凌欣等[29]結合弱酸性電位水，200～500 MPa保壓5～8 min，發現殺菌效果優于巴氏殺菌；12.5 W超聲預處理40 min后、300 MPa保壓10 min，菌落總數減少了2.5 lg CFU/mL[30]。現有的研究已證實了超高壓殺滅液態雞蛋中菌落總數的有效性，并且在研究方法上也有了一定的完善。

1.2 超高壓對沙門氏菌的影響

超高壓對細胞表面造成物理損傷，改變細胞形態特征，使細胞膜或細胞壁部分崩解，細胞質流出，最終殺滅沙門氏菌[31]。現有關于殺滅液態雞蛋中沙門氏菌也均在建立染菌模型的基礎上評價殺菌效果。在上世紀末，Ponce等[32]發現350～450 MPa保壓5～15 min可將沙門氏菌數降低0.8～8 lg CFU/mL（徹底殺滅）。值得關注的是，該研究用胰蛋白胨大豆瓊脂、煌綠磺胺吡啶瓊脂和沙門氏菌志賀氏菌瓊脂檢測同一殺菌條件下腸炎沙門氏菌在不同的培養基上的生長情況，發現在不同的培養基上呈現出了不同的殺滅效果，胰蛋白胨大豆瓊脂培養基上呈現的殺滅效果最差。Yuste等[33]也發現了類似的情況，在400 MPa、5 min下胰蛋白胨大豆瓊脂、木糖賴氨酸去氧膽酸瓊脂和薄瓊脂層培養基中均未檢出鼠傷寒沙門氏菌，經過腦心浸液肉湯富集培養后才能檢出，出現了亞致死損傷現象，遺憾的是其他研究并未注意到這一問題。如Nemeth等[26]使用營養瓊脂培養基檢測在200～400 MPa保壓3～1.7 min后沙門氏菌的殺滅情況，發現減少了4.5～6.11 lg CFU/mL。在張根生等[28]的研究中，使用亞硫酸鉍瓊脂，發現300 MPa保壓7.5 min可將沙門氏菌殺滅至無法檢出。但近幾年的研究也有一定的發展，通過借鑒柵欄技術，將超高壓協同其他殺菌方式，實現在較低壓力強度下殺滅沙門氏菌。Bari等[34]在50 ℃下350 MPa保壓11.4 min，期間使用壓力脈沖每次2 min、共4次處理后，沙門氏菌數降低8 lg CFU/mL（徹底殺滅）；Isiker等[35]發現在20 ℃下250 MPa保壓5 min后經0.5%（v/v）H2O2處理1 h可使腸炎沙門氏菌減少7～8 lg CFU/mL（徹底殺滅）；Huang等[36]發現單獨使用超高壓，可使沙門氏菌數減少0.43～2.20 lg CFU/mL，在超高壓（20 ℃下138 MPa保壓4～8 min）協同超聲（55 ℃下40 W處理5 min）后，沙門氏菌數減少3.23 lg CFU/mL。綜上，超高壓對殺滅沙門氏菌有較好效果，研究方法上可以借鑒柵欄技術與其他殺菌手段結合，但也應該注意完善評價殺菌效果的方法，液態雞蛋營養豐富，會促進亞致死的微生物復活，有必要使用高營養的培養基來檢測生殘菌數量，否則會高估實際殺菌效果。

1.3 超高壓對大腸桿菌的影響

超高壓會造成大腸桿菌細胞形態改變、細胞膜破裂和穿孔、細胞脂質膜的雙層被壓縮、細胞流動性降低、細胞質聚集或離子泄漏、降低Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性，降低不飽和脂肪酸（主要為C16：1）含量，進而殺滅大腸桿菌[37]。早些年的研究發現，5～25 ℃下250～400 MPa保壓0.38～14.77 min可殺滅0.2～8 lg CFU/mL（無法檢出），由于大腸桿菌細胞壁較厚、有較強的抗壓性[38-39]，所以在200 MPa時殺滅數較低。類似地，Yuste等[33]的研究結果發現，20 ℃下200～400 MPa保壓1～5 min可降低2.03～5.5 lg CFU/mL（徹底殺滅）；楊瑞香[25]發現在300 MPa保壓15 min可殺滅4.6 lg CFU/mL（殘菌數已符合國標要求）；張根生等[28]發現在300 MPa保壓7.5 min可殺滅至無法檢出。然而與上述研究結論不同的是，白潔等[24]發現200 MPa保壓5 min后無法檢出大腸桿菌，認為大腸桿菌對壓力敏感，其原因未知。隨著研究的不斷深入，殺滅液態雞蛋中大腸桿菌的研究也與其他殺菌方式結合進行協同殺菌，如Monfort等[40]發現，在液態雞蛋中添加2%檸檬酸三乙酯后，20 ℃下300 MPa保壓3 min大腸菌群降低超過5 lg CFU/mL。綜上，多數研究認為在300 MPa以上的壓力才能對大腸桿菌有較好的殺滅效果，并且在與其他方法協同處理后，可在較低壓力強度下使大腸菌群符合安全標準要求。

1.4 超高壓對李斯特菌的影響

超高壓通過引起細胞內部和外部結構形態變化、破壞細胞壁和細胞膜、降解膜蛋白來殺滅李斯特菌[41]。Lee等[42]研究發現在5～25 ℃下400 MPa保壓14.77 min可將李斯特菌殺滅至無法檢出；在20 ℃，300～500 MPa下保壓1～5 min可殺滅李斯特菌0.39～5 lg CFU/mL。Nemeth等[26-27]研究發現在200～400 MPa下保壓3～17 min可殺滅李斯特菌0.7～2.1 lg CFU/mL。因為李斯特菌是革蘭氏陽性菌，細胞壁較厚、肽聚糖含量較高且其分子交聯度較緊密，對機械力有一定抵抗力，所以呈現出來的殺滅效果較差。對比后可以得出短時高壓比長時低壓能殺滅更多的李斯特菌。此外，也有學者研究了協同殺菌對李斯特菌的影響，在Monfort等[40]的研究中，添加2%的檸檬酸三乙酯后，20 ℃下300 MPa保壓3 min，殺滅數大于5 lg CFU/mL。綜上，雖然李斯特菌具有一定的抗壓性，降低殺菌效果，但可以通過添加協同劑來增強殺菌效果。

1.5 超高壓對其他微生物的影響

除了上述微生物外，學者們對其他殺滅微生物也進行了一定研究。Yuste等[33]研究了對金黃葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌的影響，發現在20 ℃下、300～500 MPa保壓1～5min后，分別減少了0.26～0.38 lg CFU/mL和0.32～3.34 lg CFU/mL，證實了革蘭氏陰性菌對壓力更敏感，更易受影響。Lee等[42]研究了對熒光假單胞菌和多粘類芽孢桿菌的影響，發現在5～25 ℃下、250～400 MPa保壓14.77 min后，菌群數均減少了5 lg CFU/mL。在Nemeth等[26-27]的研究中，200～400 MPa保壓3～17 min后，金黃葡萄球菌減少了0.92～2.63 lg CFU/mL，認為壓力誘導微生物細胞結構性損傷和代謝損傷，降低了菌數。

2 超高壓對液態雞蛋理化特性的影響

2.1 超高壓對蛋白變性的影響

目前，應用于研究壓力對蛋白質影響的技術有差示掃描量熱法、凝膠電泳法、傅里葉紅外光譜、圓二色譜、紫外光譜、熒光光譜、核磁共振光譜等。不同學者在超高壓對蛋白質的影響方面存在爭議，Tóth等[23]以蛋清為原料，研究了200～350 MPa壓力下蛋白質變性情況，差示掃描量熱分析結果表明處理后的蛋清蛋白未變性。而Hoppe等[43]報道稱壓力使水進入蛋白質分子，進而誘導蛋白質變性。Andrassy等[44]報道稱250～400 MPa的壓力會導致蛋清蛋白凝聚變性；Yamamoto[45]也報道稱300 MPa的壓力會導致蛋白質凝聚變性。張根生等[28]研究發現300 MPa保壓7.5 min后蛋白變性率約為25%。此外Frydenberg等[46]報道稱變性后的蛋白質經稀釋可能會促進未折疊蛋白質重新折疊成天然狀態。綜上，在已知的有效殺菌條件下液態雞蛋蛋白質是否變性尚未有統一的結論，且缺乏關于壓力誘導蛋白質變性的系統可靠的研究。國內對超高壓處理后液態雞蛋、蛋白質結構變化方面的研究也較少。

2.2 超高壓對蛋白溶解度的影響

現有關于液態雞蛋蛋白溶解性的研究均發現溶解性隨著壓力的增加而降低[47]。對此，學者普遍認為是壓力破壞三、四級結構，使結構展開，從而使蛋白分子間的相互作用力大于蛋白質和水之間的作用力[48]。雖然已有研究表明壓力會對卵清蛋白結構造成影響[49]，但這些研究的樣本是從雞蛋中分離純化后再經壓力處理，單從蛋白角度來說，這種研究可靠、分析合理，但雞蛋復雜的成分會降低壓力對蛋白的影響[50]，所以液態雞蛋蛋白溶解性降低的機理有待深入研究。

2.3 超高壓對其他理化特性的影響

目前，在對粘度的研究中，用于測定粘度儀器的有流變儀[31,40]和普通的粘度計[28]，研究結論均為液態雞蛋經超高壓處理后，粘度隨壓力升高而增加[47-48]。在對色度的研究中，顏色測定結果的表達形式有多種，如白度、色度、色差等，但測定結果普遍為L值隨壓力升高而增加[25]，即亮度增加；a值（紅/綠）隨壓力升高而降低，即偏綠；b值（黃/藍）隨壓力升高而升高[27-29]，即偏黃。總體而言，液態雞蛋經超高壓處理后，顏色泛白、偏黃[51-53]。關于表面巰基含量的研究中，Wang等[53]研究發現巰基含量在100 MPa時最高，在200～400 MPa下不斷降低；楊瑞香[25]也得出了類似的結論，在100 MPa內巰基含量先增加，但隨著壓力在升高，200～400 MPa下巰基開始被包埋，巰基含量降低。總言之，液態雞蛋受壓后表面巰基含量先增加，在200 MPa后出現逐漸降低。表面疏水性隨著壓力的增加，蛋白結構被破壞，維持三級結構的疏水相互作用減弱作用、同時疏水集團被包埋[25,47]，疏水性區域減小[54-55]，蛋白的疏水性降低[56-57]。對凝膠性能的研究發現，壓力促進了蛋白聚集、產生凝膠，同時改變溶膠-凝膠轉變的線性粘彈性行為。楊瑞香[25]發現凝膠強度隨壓力增大而增加。Singh等[57]對此作了進一步研究，發現液態雞蛋在所使用的頻率范圍（0.1～10 Hz）內表現出固態行為。壓力和保壓時間對液態雞蛋凝膠化有顯著影響；雞蛋成分在凝固、變性時呈現出液-固凝膠轉變；隨著稠度行為的增加和流動行為指數的降低，流體表現為假塑性流體；隨著壓力強度的增加，液態雞蛋從流動的類液體行為逐漸過渡到半粘性行為，再到高粘性行為[51,57]。關于超高壓對液態雞蛋發泡性能的影響，以往的研究認為起泡性和發泡穩定性隨著壓力水平強度的增加而增加[25,56-57]，但最新的研究發現當壓力在300～400 MPa范圍內，起泡性隨壓力增加而降低。這與以往的研究結論不同，對此，該學者認為是設備泄壓速率不同，出現空化效應，降低巰基暴露，進而影響起泡性[28]。綜上，液態雞蛋蛋白受壓后結構變化影響發泡性能的機理也有待進一步深入研究。學者們研究了壓力對液態雞蛋乳化性、乳化穩定性、乳化活性指數的影響，普遍發現隨著壓力的升高，乳化性[25]、乳化穩定性[40,57]、乳化活性指數降低[58-60]。Andrassy等[44]使用電子鼻研究受壓后液態雞蛋產生的揮發性化合物，發現樣品的質量點與初始對照樣品的質量點相似，認為沒有異味產生。

3 結語

目前已有大量研究證實了超高壓技術對殺滅液態雞蛋中沙門氏菌和大腸桿菌等有害微生物有較好殺滅效果，同時對液態雞蛋理化特性和功能特性有一定的影響。但也存在評價殺菌的方法不全面，未考慮亞致死損傷的外生物、缺乏研究壓力對液態雞蛋中蛋白質結構影響的研究，更重要的是缺乏與熱巴氏殺菌作比較的研究。所以之后的研究可以借鑒現有的經驗，建立染菌模型，將超高壓協同其他殺菌技術，使用高營養的培養基研究殺菌效果；液態雞蛋超高壓處理后分離純化蛋白，進行蛋白結構研究，探討對理化特性和功能特性影響的機理。超高壓技術屬于非熱加工技術，有著巨大的發展潛力，在進一步完善后，應用到液態雞蛋生產加工中，必將會有廣闊的發展前景。