不同接種方式下小片球菌C30對‘赤霞珠’葡萄酒品質的影響

浩楠，馬騰臻，2，楊學山，2，張波，2，韓舜愈，2，3*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州，730070)3(中國葡萄酒產業技術研究院，寧夏 銀川，750021)

蘋果酸乳酸發酵(malolactic fermentation, MLF)是葡萄酒的“二次發酵”，該過程不僅使葡萄酒脫酸產生更柔軟的口感，而且通過除去具有生物活性的有機酸(L-蘋果酸)來提高葡萄酒的微生物學穩定性和改善葡萄酒感官品質[1]。傳統的葡萄酒釀造通常采用酵母先進行酒精發酵(alcohol fermentation，AF)，后利用乳酸菌自然啟酵或人工接種乳酸菌進行MLF，其弊端主要為釀造時間較長，成本較高，且AF后再進行MLF時已進入秋季，溫度降低抑制了MLF的啟動。若能在AF過程中接種乳酸菌進行MLF，則可節約時間、降低成本，同時獲得較好的MLF啟動條件。但有研究發現在AF過程中接種乳酸菌進行MLF存在酵母與乳酸菌之間的拮抗作用，影響葡萄酒品質或導致葡萄酒釀造的失敗[2]。

小片球菌(Pediococcusparvulus)是啟動MLF的乳酸菌之一，前期自篩得到了P.parvulusC30，具有不亞于商品乳酸菌的釀造特性[3]。過去認為片球菌屬細菌因其會導致葡萄酒黏稠、產生不良風味次級代謝物，是葡萄酒中的腐敗菌[4-5]。但隨著研究的深入，發現某些片球菌屬細菌不僅能完成MLF而且對葡萄酒的風味、感官等具有積極影響。JUEGA 等[6]將本土有害片球菌(Pediococcusdamnosus)應用在Albario和Caio葡萄酒中進行MLF，發現葡萄酒未變質且賦予葡萄酒蜂蜜香氣與濃郁酒香。劉莉萌等[7]也從白酒窖池中分離出了2個新種：酒窖片球菌(Pediococcuscellicola)和耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans)。因此，研究葡萄酒中存在的片球菌屬細菌對葡萄酒的品質影響，對國內地域特色葡萄酒的釀造具有重要的意義。

本實驗以甘肅河西走廊產區“赤霞珠”葡萄為原料，將自篩P.parvulusC30在葡萄酒AF過程中的早、中、后期分別進行接種，并以商品菌株OMEGA與VP41為對照觸發MLF，比較在不同接種時期下P.parvulusC30的發酵動力學、安全性及對黑比諾葡萄酒各理化參數、顏色和香氣成分等品質的影響，并結合感官評價探討P.parvulusC30在干紅葡萄酒釀造工藝中的應用潛力，以期改進葡萄酒釀造工藝，節約釀造時間，降低釀造成本，為甘肅河西走廊葡萄酒產區釀造區域特色風格的干紅葡萄酒提供依據與開創新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：本試驗所用乳酸菌為實驗室自篩P.parvulusC30；赤霞珠(Cabernet Sauvignon)葡萄，含糖量約為26.2～26.4 °Brix，2017年采樣于甘肅武威莫高酒業有限責任公司。

藥品與試劑：釀酒酵母(LALVIN BM4X4)，丹麥Home Brew Ohio公司；商品乳酸菌(OMEGA和VP41)、果膠酶(Cuvee Blanc)，法國Lallemand公司；福林酚、福林丹尼斯、2-辛醇(色譜純)、放線菌酮，美國Sigma公司；L-蘋果酸、L-乳酸含量測定試劑盒，愛爾蘭Megazyme公司；無水葡萄糖、沒食子酸及無水碳酸鈉等其他試劑均為國產試劑；費林試劑、次甲基藍及酚酞指示劑等均按GB/T 603—2002《化學試劑 試驗方法中所用制劑及制品的制備》進行配制。

1.2 儀器與設備

827型pH計，上海雷磁公司；Genesis 10S型紫外-可見分光光度儀、RACE 1310氣象色譜-質譜聯用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm，0.25 μm)，美國Agilent Technologies公司；固相微萃取(solid phase microextractio，SPME)裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅(divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-siloxane，DVB/CAR/PDMS)萃取頭，美國Surpelco公司；SPX-150-II生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；1810 D超純水機，重慶摩爾水處理設備有限公司；CP 214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；Mix Plus漩渦振蕩儀，合肥艾本森科技儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 釀造發酵實驗

葡萄酒的釀制：篩選適量品質較好且成熟度一致的赤霞珠葡萄除梗破碎后分裝于2.5 L發酵罐中，添加50 mg/L SO2(以偏重亞硫酸鉀形式)及200 mg/L果膠酶，低溫浸漬72 h后，接種0.2 g/L釀酒酵母 BM 4X4并于22 ℃下進行AF，按照以下3種接種方式進行釀造[8]：

早期接種：在接種酵母菌進行AF后的24～72 h內接種P.parvulusC30、商品乳酸菌OMEGA與VP41。

中期接種：在接種酵母菌進行AF的1/2～2/3過程中接種P.parvulusC30、商品乳酸菌OMEGA與VP41。

后期接種：在接種酵母菌完成AF后接種P.parvulusC30、商品乳酸菌OMEGA與VP41。

至殘糖低于4 g/L且通過紙層析法判斷MLF完成，進行2次倒罐去酒泥并用0.45 μm濾膜過濾，酒樣在低溫下密封貯存備用。所有實驗均設置3個平行。

1.3.2 MLF發酵動力學測定

乳酸菌生物量監測：采用平板計數法[9]。在發酵過程中每隔3 d取酒樣，用生理鹽水稀釋成10-7～10-1菌懸液。吸取0.1 mL 10-7～10-5各菌懸液，涂布于添加50 mg/L放線菌酮的乳酸細菌培養基上。27 ℃培養5 d后觀察各菌落形成情況并計數，菌落總數以菌落形成單位(CFU/mL)表示。

蘋果酸、乳酸含量監測：采用試劑盒測定。在發酵過程中每隔3 d取酒樣，并以紙層析法判斷L-蘋果酸斑點消失，則MLF結束。將待測酒樣以體積比1∶10稀釋后，用96孔微孔板在340 nm下分析，根據公式(1)計算：

(1)

式中：標準L-蘋果酸和L-乳酸的質量濃度為0.15 mg/mL;n，稀釋倍數。

1.3.3 葡萄酒安全性測定

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)測定：參照郝蘭蘭等[10]同位素內標定量的氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法測定。

生物胺測定：采用(氯仿∶正丁醇)萃取劑提取內標定量的超高壓液相色譜-串聯質譜(ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS)法[11]。

多糖測定：多糖的提取采用無水乙醇法，多糖含量采用苯酚硫酸法測定[12]。

1.3.4 葡萄酒基本理化指標的測定

依據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]測定發酵液中總糖、總酸、揮發酸含量、pH等指標，乙醇體積分數的測定采用沸點測定儀。

柔和指數的測定參照張佳濤[14]方法，按公式(2)計算：

S=φ乙醇-(ρ總酸+ρ單寧)

(2)

式中：S，樣品柔和指數；φ乙醇，乙醇體積分數，%；ρ總酸，總酸含量，g/L；ρ單寧，單寧質量濃度，g/L。

色度、色調：參照SIMONATO等[15]方法，測定酒樣在波長為420、520和620 nm處的吸光度值，即A1、A2、A3，三者之和為酒樣色度，前兩者之比為色調。

1.3.5 葡萄酒揮發性化合物的測定

香氣富集：取8 mL酒樣于15 mL樣品瓶中，加入2.5 g NaCl和10 μL 2-辛醇(內標物)，加轉子密封，40 ℃恒溫攪拌30 min后頂空萃取30 min。萃取結束后，取出萃取頭插入GC-MS聯用儀進行香氣檢測[16]。

1.3.6 感官評價

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]，并略作調整。由11位葡萄酒專業人員及組成評價小組。分別從色澤(10分)、澄清度(10分)、香氣(30分)、口感(40分)與典型性(10分)5個方面對酒樣進行感官評價，標準如表1。

表1 葡萄酒感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evalution of wine

1.4 數據處理與分析

數據采用Excel 2010進行計算及相關圖表繪制，SPSS 20.0軟件進行統計分析、單因素方差分析、主成分分析等。

2 結果與分析

2.1 MLF動力學分析

2.1.1 不同接種方式進行MLF對P.parvulusC30生物量的影響

由圖1可知，接種3株乳酸菌后，菌體數量呈先下降后上升再下降的趨勢，最終保持在105CFU/mL。這主要是由于AF時，酵母大量生長并產生酒精對乳酸菌的生長造成了一定的抑制作用[17]。在早期與中期接種方式下，P.parvulusC30在第42天與第39天完成MLF，較2株商品菌株慢。而在后期接種方式下，P.parvulusC30在第27天完成MLF，較2株商品菌株快。表明，P.parvulusC30在后期接種具有一定的優勢。

圖1 不同接種方式對菌株的生物量的影響Fig.1 Effect of different inoculation methods on the growth of strains

2.1.2 不同接種方式進行MLF過程中L-蘋果酸和L-乳酸含量的變化

由圖2-a、圖2-b可知，在早期、中期、后期接種方式下，酒樣中L-蘋果酸的含量隨著發酵時間的增加而逐漸減少，L-乳酸的含量隨著發酵時間的增加而逐漸增加。與2株商品菌株相比，P.parvulusC30在后期接種方式下的L-蘋果酸含量最低，L-乳酸含量最高。雖然在早期與中期接種P.parvulusC30可以完成MLF，但其發酵時間較商品菌株長。表明P.parvulusC30在不同接種方式下具有較好的L-蘋果酸分解能力。

a-L-蘋果酸含量的動力學；b-L-乳酸含量的動力學圖2 發酵過程中L-蘋果酸和L-乳酸含量的動力學Fig.2 Kinetics of L-malic acid and L-lactic acid during MLF of wine

2.2 葡萄酒的安全性分析

片球菌屬細菌是產生生物胺與EC的主要菌種，這些物質的存在會對人體產生危害。此外，片球菌還會產生胞外多糖而引起葡萄酒黏稠[18-19]。由表2可知，不同接種方式下進行MLF后酒樣的EC及7種生物胺含量均低于國際相關標準。其中，P.parvulusC30發酵酒樣的酪胺、色胺差異與商品菌株差異不顯著,而腐胺、組胺含量在早期接種時較商品菌株差異顯著。此外，P.parvulusC30發酵酒樣的多糖含量差異顯著但不會引起葡萄酒的黏稠。表明，P.parvulusC30發酵葡萄酒具有安全性。

表2 葡萄酒中氨基甲酸乙酯、生物胺及多糖含量Table 2 Ethyl carbamate, biogenic amine and polysaccharide content of wines

2.3 葡萄酒理化指標分析

由表3可知，與未進行MLF的酒樣相比，經3種不同接種方式進行MLF后，發酵酒樣的殘糖含量差異不顯著(約為3.00 g/L)，酒樣的乙醇體積分數在14.00%～16.00%，揮發酸含量低于1.20 g/L。P.parvulusC30發酵酒樣總酸含量在后期接種下降幅最大，下降21.93%，pH則隨著總酸的降低而升高，酒樣的柔和指數上升，色度值降低、色調值升高。綜上，表明P.parvulusC30對葡萄酒的基本理化指標影響較小，具有較好的應用潛力。

表3 不同接種方式對葡萄酒基本理化指標的影響Table 3 Physico-chemical indices of wine under different inoculation methods

2.4 不同接種方式進行MLF對葡萄酒香氣的影響

2.4.1 葡萄酒揮發性化合物分析

結合以上分析結果，采用HS-SPME-GC-MS法對酒樣的揮發性香氣化合物進行了檢測分析(詳細數據見附件表1)。共檢出106種香氣物質，包括42種酯類(約占香氣總量32.46%～47.84%)、27種醇類(45.69%～59.94%)、15種有機酸類(3.18%～7.34%)、10種羰基類(0.01%～0.19%)、8種萜烯類(0.16%～0.76%)及4種其他化合物(0.02%～0.52%)。不同處理酒樣的香氣物質種類及含量有所差異：與未進行MLF相比，MLF后的P.parvulusC30酒樣香氣總量均低于未進行MLF的酒樣，后期接種P.parvulusC30酒樣香氣含量較商品菌株顯著高(P<0.05)。與商品菌株相比，早期與中期接種P.parvulusC30發酵酒樣的酯類物質總含量較商品菌株顯著低，分別為0.79倍與0.75倍；醇類物質中的2-甲基-1-丁醇、正己醇及苯乙醇含量顯著低于商品菌株VP41發酵酒樣。而后期接種P.parvulusC30發酵酒樣中辛酸乙酯、丙酸辛酯等含量較高，賦予葡萄酒果香、蜂蠟香，醇類物質中的正戊醇、4-甲基1-戊醇、芐醇等的含量較商品菌株顯著高，賦予葡萄酒酒香、檸檬香、玫瑰花香等氣味，但呈現紅色水果香、酒香的正己酸乙酯、癸酸乙酯含量較低且帶有生青味。萜烯類物質是葡萄重要的特征香氣[20]，數據顯示后期接種P.parvulusC30酒樣中萜烯類物質的總含量較商品菌株顯著高，其發酵酒樣中香茅醇與大馬士酮含量較高，賦予葡萄酒柑橘香、玫瑰花香氣味，但在花香、清香氣味方面略差。

2.4.2 主成分分析

由于葡萄酒香氣成分復雜多樣，且不同酒樣香氣物質的種類及含量有所差異，因此可通過主成分分析這種多元統計分析方法進行降維，而后研究各處理酒樣的香氣變化并對其品質進行綜合評價[21]。以特征值大于1為依據，共提取7個公因子，其中，PC1、PC2和PC3的累計方差貢獻率為72.96%，基本可以解釋原變量大多數的變異信息。

載荷系數反映原始變量與主成分間的相關性，即初始變量在降維后因子中的貢獻率大小[22]。由圖3-a、圖3-b可知，PC1主要反映了乙酸苯乙酯、芐醇、苯乙醇、己酸等香氣化合物的變異信息(載荷系數>0.8)，甲酸異戊酯、辛酸甲酯等則與PC1呈負相關；PC2主要體現了2-甲基戊酸，正己酸乙酯和庚酸乙酯在PC2上的載荷系數則為負；而PC3主要由苯甲醛(正相關)和2,3-丁二醇(負相關)所貢獻。

a-PC1-PC2因子載荷圖；b-PC1-PC3因子載荷圖；c-樣品分布圖圖3 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖及樣品分布圖Fig.3 Loadings plot and score plot from principal component analysis of volatile aroma compounds

圖3-c為主成分分析的樣品分布圖，早期與中期接種P.parvulusC30處理的PC2得分高于平均水平，但其PC1和PC3得分較低，說明早期接種P.parvulusC30發酵酒樣中水楊酸甲酯、正戊醇、辛酸等含量低于其他處理，而對辛酸甲酯、正己酸乙酯和庚酸乙酯等無太大影響。此外，后期接種P.parvulusC30發酵酒樣的PC1和PC3得分最高，PC2得分最低，說明后期接種P.parvulusC30發酵酒樣的香氣物質較商品菌株差異顯著。

2.5 不同接種方式進行MLF后葡萄酒的感官分析

由圖4可知，所有經MLF的酒樣的酒體豐滿圓潤、口感柔和協調。中期接種P.parvulusC30發酵酒樣的澄清度與色澤評分最高；與商品菌株相比，早期接種P.parvulusC30發酵酒樣的香氣濃度和酒體豐滿度、濃郁度、結構感、平衡感都差異顯著，但中期與后期接種P.parvulusC30發酵酒樣的典型性較高。表明P.parvulusC30在釀造區域特色干紅葡萄酒中具有一定的應用潛力。

圖4 葡萄酒感官感官分析雷達圖Fig.4 Radar map of sensory analysis of wine

3 討論

3.1 不同接種方式進行MLF的選擇

葡萄酒的釀造主要包括由酵母代謝糖類產生乙醇的AF過程與乳酸菌利用L-蘋果酸產生L-乳酸的MLF過程[23]。MLF是降低葡萄酒酸度、改善風味的重要方式，傳統的工藝是在酵母進行AF后經乳酸菌自然啟酵或人工接種商品乳酸菌進行MLF[1,23]。然而，由于AF結束后葡萄酒中乙醇體積分數高、pH低等嚴苛的環境因素會使MLF難以啟動與控制，造成MLF的延遲、增加葡萄酒被微生物感染的風險，甚至會產生一些不良物質[24]。目前研究發現，某些乳酸菌可與酵母以不同的接種方式進行接種，進而達到MLF的順利進行且縮短發酵時間[17,25]。然而，一些學者研究發現在AF過程中接種乳酸菌進行MLF存在酵母與乳酸菌之間的拮抗作用，導致AF的延遲或終止，或產生具有不良氣味的代謝產物[2,26]。

前期從自然啟酵的葡萄酒中分離獲得1株具有啟動MLF且發酵性能優良的P.parvulusC30[3]，本實驗對所篩選的P.parvulusC30以不同接種方式進行MLF，結果發現P.parvulusC30并沒有與酵母產生拮抗作用且能順利完成MLF，揮發酸也在標準限定范圍內，但其在早期與中期接種發酵總時間較商品菌株顯著長。而在后期接種時其總發酵時間較商品菌株短，且發酵酒樣的香氣物質總含量高，這使得在后期接種方式下葡萄酒的果香、酒香更加濃郁，與EDWARDS等[27]研究結果相一致，在赤霞珠葡萄酒中小片球菌改變了葡萄酒的酒香等氣味。然而，目前片球菌屬細菌對葡萄酒品質影響的研究較少，因此本研究對葡萄酒進行MLF具有重要的意義。

3.2 片球菌屬細菌進行MLF對葡萄酒品質的影響

目前已確定可進行MLF的乳酸菌分別為酒球菌屬(Oenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)[28]。其中，酒類酒球菌(Oenococcusoeni)與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)因其快速啟動MLF、耐受性能優良、產香能力強等優點在葡萄酒MLF中得到廣泛使用[29-31]。通常認為片球菌屬細菌是葡萄酒中的腐敗細菌，因為某些菌株可產生胞外多糖導致葡萄酒“黏稠病”、造成葡萄酒顏色損失及產生不良的風味物質與代謝副產物(生物胺、EC等)[4-5,32]。然而，現已在全世界范圍的葡萄酒中發現片球菌屬細菌的存在，并有學者研究發現在某些情況下片球菌屬細菌可能會增加葡萄酒的風味和香氣，不一定會引起葡萄酒的腐敗變質[6-7,33]。本實驗結果表明接種P.parvulusC30進行MLF，酒樣具有安全性[34]。另外，有研究發現在發酵過程中片球菌屬細菌會產生高濃度的乙酸及揮發酸[35]使葡萄酒具有尖酸風味，本實驗P.parvulusC30發酵酒樣的總酸和揮發酸含量均在干紅葡萄酒正常發酵范圍內(表3)。此外，經MLF后的葡萄酒的色調值升高、色度值降低這一結果與文獻報道一致[36]。總體而言，采用P.parvulusC30進行MLF后對葡萄酒理化指標與顏色品質影響較小。

葡萄酒的風格與特色主要是由酒體中不同香氣物質共同作用的結果。MLF作為“二次發酵”對葡萄酒感官品質具有較大的影響，接種的乳酸菌不同其產生的風味物質也不同。多數研究認為片球菌屬細菌的生長會使葡萄酒腐敗，產生異味和不良風味[18-19,37]。然而有少量研究發現，P.parvulus改變了未被認為變質的赤霞珠葡萄酒的酒香[27]以及片球菌屬細菌具有大量的酶編碼基因，這對葡萄酒香氣的產生具有重要作用[19]。本實驗研究表明P.parvulusC30可賦予葡萄酒蜂蠟香、酒香、玫瑰香等香氣但略帶生青氣味，小片球菌改變了赤霞珠葡萄酒的酒香、甜香味[20]。并且在后期接種P.parvulusC30酒樣中的香茅醇與大馬士酮含量顯著高與商品菌株發酵酒樣。STRICKLAND等[34]也研究了片球菌對葡萄酒感官品質的影響，經評價小組評價并未感覺到不良的黃油風味，這一研究也支持了本研究的感官分析結果。

4 結論

P.parvulusC30具有較好的降酸能力及MLF動力學，可用于赤霞珠葡萄酒的MLF。其在AF的早、中、后期接種進行MLF發酵的酒樣符合葡萄酒釀造標準、具有安全性，且其產生的香氣物質(苯乙醇、芐醇、香茅醇、大馬士酮等)對葡萄酒品質有積極影響。尤其在AF后期進行MLF葡萄酒的酒香豐盈，口感圓潤，品質較好，有助于區域特色干紅葡萄酒的釀造。