抗凝血酶III通過SIRT1-NF-kB通路發揮腎保護作用

吳本鶴，薛 飛，張漢妤，朱 云*

（揚州大學附屬江蘇省蘇北人民醫院，江蘇 揚州 225001）

膿毒癥是一種由細菌感染引發的全身擴散性炎癥反應，是重癥監護室內病患死亡的最主要原因，然而，目前臨床上沒有特別的治療膿毒癥的辦法。

近來研究發現抗凝血酶I I I 具有抗炎作用。多項研究[1-2]顯示，AT-III缺乏導致腎損傷加重。NF-kB是一種經典的信號傳導通路，其可通過與Sirt1蛋白結合使TNF-α等炎癥因子的產生減少[3]。

本課題通過研究AT-III對膿毒癥腎臟炎癥因子表達的影響，并進一步研究經治療后STRI1-NF-kB通路蛋白變化，對其腎臟保護的可能機制進行初步研究，以期為膿毒癥的治療提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組及方法

30只ICR小鼠購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場（生產許可證編號：SCXK（京）2017-0001），體重18～22 g。將小鼠隨機分為兩組，分別為假手術組（Sham組）10只、CLP組20只。AT-III給藥量按200ug/kg計。

1.2 模型制備：

參照文獻[4]術式，即：麻醉小鼠后，取腹部正中切口3cm，查找并分離盲腸，于盲端處結扎，用穿刺針在結扎處遠端貫穿盲腸，再將盲腸回納，關閉腹腔。假手術組手術方式同前，腹腔注射氯化鈉溶液2ml。

1.3 標本采集

分別于造模后0h、6h、12h經髂外靜脈采血2ml，將標本靜置1h后按4500r/min離心5分鐘，取上清液，置于-80℃冰箱保存。處死大鼠，取出右側腎臟，固定于甲醛溶液中。

2 實驗方法

2.1 膿毒癥腎損傷標志物檢測

按照Ccr、BUN及NGAL ELISA試劑盒 (美國R&D Systems公司)說明進行操作，依標準曲線計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數得到各樣品的實際濃度。

2.2 腎臟組織中炎癥因子的表達

固定腎組織，經脫水、包埋、切片，然后再脫蠟、脫水、滅活、抗原修復，以5%胎牛血清室溫孵育1 h，分別加入兔抗大鼠TNF-a、IL-1β和IL-6多克隆一抗(稀釋比均為1：100)，4℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG二抗(稀釋比為1：1000)37℃孵育1h，然后顯色、復染、封片。200倍光學顯微鏡下，利用多媒體彩色圖像分析系統觀察上述因子的陽性表達(棕黃色)。

2.3 Western bloting檢測NF-kB和SIRT1蛋白的表達

將腎組織研磨成勻漿，12000r／min離心15 min，蛋白上樣進行SDS-PAGE，電泳后將蛋白轉移到 PVDF膜上，室溫封閉1 h，分別加入一抗稀釋液(p-NF-kB和SIRT1均為1：1 000)，4℃孵育過夜，然后用二抗稀釋液(羊抗兔二抗為1：2000)，室溫孵育1 h，用ECL顯影液顯色，凝膠成像系統進行曝光成像，采用Im-ageJ圖像分析軟件對圖片吸光度值進行分析。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，采用完全隨機設計方差分析進行多樣本均數比較，各組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

4 結 果

4.1 血清中SCr、BUN和NGAL變化

Sham組術后各時間點血清Scr、BUN和NGAL濃度變化無統計學意義（P＞0.05）；而在CLP組中，術后各時間點各指標濃度隨時間延長濃度升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。CLP組與Sham組對應時間點上述指標比較，差異亦具有統計學意義（P＜0.05）。見表1、表2、表3。

表1 兩組各時間段NGAL(u/l)變化（ ±s）

表1 兩組各時間段NGAL(u/l)變化（ ±s）

時間 Sham組 CLP組 t值 P值0h 32.96±2.54 32.53±2.23 0.402 0.692 6h 32.67±2.99 102.10±2.79 -53.705 0.000 12h 32.19±2.98 132.30±2.45 -82.102 0.000 F值 0.456 2322.224 P值 0.715 0.000

表2 兩組各時間段變化Scr（umol/l）（ ±s）

表2 兩組各時間段變化Scr（umol/l）（ ±s）

時間 Sham組 CLP組 t值 P值0h 71.03±3.12 72.31±2.69 1.030 0.317 6h 73.88±3.85 86.56±4.13 -7.098 0.000 12h 73.87±4.34 95.25±6.59 -8.567 0.000 F值 1.267 645.329 P值 0.300 0.000

表3 兩組各時間段BUN（mmol/l）變化（ ±s）

表3 兩組各時間段BUN（mmol/l）變化（ ±s）

時間 Sham組 CLP組 t值 P值0h 7.50±0.36 7.20±0.35 1.893 0.075 6h 7.35±0.50 8.65±0.55 -5.510 0.000 12h 7.20±0.53 12.45±0.55 -21.789 0.000 F值 0.839 372.059 P值 0.481 0.000

4.2 腎臟組織中炎癥因子的分布

CLP組小鼠腎臟組織中炎癥細胞的表達較假手術組明顯增多（P＜0.05）；使用AT-III后，各炎癥細胞的表達較CLP組顯著減少（P＜0.05）。見圖1～3。

圖1 CLP組和CLP+AT-III組大鼠腎臟組織中白細胞介素1β（IL-1β）表達（棕黃色）情況。（圖中標尺為20um）。

圖2 CLP組和CLP+AT-III組大鼠腎臟組織中白細胞介素6（IL-6）表達（棕黃色）情況。圖片標尺為20um

圖3 CLP組和CLP+AT-III組大鼠腎臟組織中腫瘤壞死因子a（TNF-a）表達（棕黃色）情況。圖片標尺為20um

4.3 各組乙酰化NF-kB蛋白和SIRT1蛋白的表達

CLP組中細胞表達SIRT1蛋白降低，乙酰化NF-kB蛋白表達增加（P＜0.05）。 AT-III可以促進SIRT1蛋白的表達，使NF-kB乙酰化水平降低（P＜0.05）。 兩組均較正常對照組比較有顯著差異（P＜0.05 ），見圖4、圖5。

5 討 論

膿毒癥(Sepsis)是由于微生物或其他病原體侵入人體而誘發的過度激烈的全身炎癥反應，全球每年有超過1800萬的重癥病例[5]。腎臟常常是膿毒癥瀑布式炎癥反應最常攻擊的器官之一，然而對其具體機制仍不明確。目前越來越多的證據表明，大量炎癥因子的高表達是導致急性腎損傷的重要原因[6]。本研究中我們也發現，在膿毒癥模型組中，TNF-a和IL-1β、IL-6等炎癥因子表達明顯增加。因此控制細胞因子的產生和抑制細胞因子導致的下游炎癥信號通路的激活是治療膿毒癥腎損傷的有效手段[7]。

圖4 不同組別NF-kB p65和SIRT1蛋白表達的差異

抗凝血酶Ⅲ( antithrombinⅢ，AT-Ⅲ)在人體凝血和纖溶抗凝系統的平衡中起著重要的作用。此外，AT-III在機體抗炎反應中亦發揮重要的作用，對全身炎癥反應綜合征和多器官功能功能障礙均具有治療作用。本研究中我們也觀察到，在使用AT-III治療模型組中，腎臟組織內各炎癥因子表達明顯下降，進一步證實了AT-III具有切實有效的炎癥清除能力。

NF-kB廣泛參與細胞調亡、免疫應答、炎癥反應等生物學過程[8]，NF-kB乙酰化沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，Sirt1）能夠調控炎癥、參與氧化應激等[9]。Sirt1可通過去乙酰化與NF-kB的亞單位RelA/p65發生反應，使影響NF-kB活性的基因表達缺失，NF-kB與核內炎癥基因結合減少，進而MCP-1、TNF-α等一些炎癥因子的產生也相應減少。

本研究中，我們觀察到經過AT-III治療后，腎臟組織內SIRT1蛋白表達明顯增加，相應的 NF-kB蛋白明顯下降，提示其可能通過SIRT1-NF-kB通路發揮保護作用，但仍需大量研究進一步證實。