CD4+CXCR3+T細胞、IP-10及IFN-γ在原發免疫性血小板減少癥中的表達及臨床意義

趙雪蕓，段曉靜，賈瑞萍*

（1.包頭市中心醫院血液科，內蒙古 包頭 014040；2.赤峰學院第二附屬醫院腫瘤科，內蒙古 赤峰 024000）

原發免疫性血小板減少癥（P r i m a r y i m m u n e thrombocytopenia，ITP），是一種臨床常見的獲得性自身免疫性出血性疾病[1]。根據病程及嚴重程度可將ITP分為新診斷的ITP、持續性ITP、慢性ITP、重癥ITP、難治性ITP[2]。成年ITP易發展為慢性、重癥及難治性ITP，且存在易復發、經濟負擔重等疾病特點，嚴重降低了患者的生活質量。然而迄今為止，ITP的發病機制尚不完全明了。

趨化因子是多成員構成的細胞因子超家族，與其受體結合后，控制免疫細胞定向遷移，使后者到達炎性反應部位，行使清除抗原、促進創傷愈合、維持組織細胞平衡、消滅異常增殖細胞等功能[3]。趨化因子及其受體的異常表達和分布將導致免疫細胞的錯誤定位和功能障礙，這將嚴重影響機體的正常免疫平衡。輔助性T細胞（Helper T cell，Th）是機體內發揮重要功能的免疫細胞，根據分泌的細胞因子和功能可分化成不同亞群，如Th1、Th2、Th17等。每個亞群的分化過程中也伴隨一些標志性趨化因子受體的表達變化，比如趨化因子受體3（Chemokine receptor 3，CXCR3）標志性表達于Th1細胞。干擾素誘導蛋白10（Interferon-inducible protein 10，IP-10）是CXCR3的配體，它可以由體內多種類型細胞分泌（如單核細胞、內皮細胞、成纖維細胞）。IP-10能夠根據其濃度梯度吸引表面表達CXCR3的Th1細胞，二者結合后發揮作用并使后者發生遷移定位至炎癥部位，參與炎性免疫反應。目前已有很多研究檢測ITP中的Th1、Th2細胞比例，確認ITP是一種Th1優勢性免疫疾病[4]。推測IP-10/CXCR3趨化軸可能在增強Th1細胞的募集和活化中發揮作用，進而參與ITP的免疫病理過程。我們分別檢測新診斷的ITP糖皮質激素治療前及治療1周后外周血CXCR3表達與IP-10、IFN-γ水平，進一步探討IP-10/CXCR3趨化軸在ITP發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018年03月～2019年01月就診于包頭市兩所三級甲等醫院（包頭市中心醫院、包頭醫學院第一附屬醫院）新診斷的成年ITP患者30例作為病例組，其中男性14例，女性16例，年齡22～82歲，平均52歲，血小板計數（2～38）×109/L；選擇健康志愿者20例為對照組，其中男性8例，女性12例，年齡23～80歲，平均45.8歲，兩組性別與年齡比較差異無統計學意義。診斷標準及療效評價均依據侯明等編著的《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》。排除標準：排除其他繼發性血小板減少癥。

1.2 治療方法及療效分組

所有ITP患者均靜脈滴注甲潑尼龍琥珀酸鈉0.8 mg/kg.d治療，PLT≥100×109/L后改為甲潑尼龍片口服。如治療前血小板水平低于10×109/L，且伴有出血或有出血風險時，給予輸注單采血小板及丙種球蛋白。入組ITP患者接受糖皮質激素治療1周后的療效分組：完全反應組：19例，治療后PLT≥100×109/L且無出血；有效組：11例，治療后PLT≥30×109/L或大于初診時血小板計數的2倍且無出血。

1.3 主要試劑與儀器

鼠抗人C D 4 異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）抗體、鼠抗人CXCR 3 藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）抗體購自美國Biolegend公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、紅細胞裂解液（1X）、人IP-10 ELISA試劑盒（96T）、人IFN-γ ELISA試劑盒（96T）均購自杭州聯科生物技術有限公司。FACS Canto TM Ⅱ型流式細胞儀購自美國Becton Dckinsoni公司；Multiskan MK3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.4 標本采集及處理

抽取病例組（新診斷時和治療1周后）與對照組晨起空腹外周靜脈血3ml，放入EDTA抗凝管，充分混勻，吸取200 ul在4小時內完成CD4+CXCR3+T細胞流式細胞術檢測；剩余全血3000轉/分鐘離心15 min，將上清液移入2ml的Eppendorf管中，置于超低溫冰箱冰凍（-80℃）保存，用于IP-10及IFN-γ的定量檢測。

1.5 流式細胞術檢測樣本CD4+CXCR3+T細胞表達率

在流式細胞管中加入混合均勻的50ul EDTA抗凝全血、5ul FITC-CD4抗體、5ul PE-CXCR3抗體，設空白對照管，在室溫下避光孵育30分鐘；向每個流式管加入300ul 1x紅細胞裂解液以裂解紅細胞，輕輕混合，在室溫下避光15分鐘；加入PBS緩沖液lml，輕輕混合，1800轉/分鐘離心7分鐘，棄上清液；加入200ul PBS重懸細胞，上機檢測。以前向角（Forward scatter，FSC）和側向角（Side scatter，SSC）為雙參數，圈定CD4+T淋巴細胞門，在CD4+T淋巴細胞門內以FITC及PE為雙參數，圈定CD4+CXCR3+T細胞群，所得數據即為CD4+CXCR3+T細胞在CD4+T細胞中所占比例（%），記錄各標本CD4+CXCR3+T細胞表達率。

1.6 酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）雙抗體夾心法檢測IP-10、IFN-γ

操作步驟嚴格按照聯科生物技術有限公司人IFN-γ ELISA試劑盒（96T）及人IFN-γ ELISA試劑盒（96T）說明書進行。

1.7 統計學方法

本研究中所有數據統計使用SPSS23.0統計軟件完成。計數資料用頻數（百分比）表示，病例組與對照組比較采用x2檢驗；正態分布計量資料用均數±標準差（±s）表示，病例組與對照組均數比較采用兩樣本t檢驗，治療前、后組均數比較采用配對樣本t檢驗；對部分指標作兩樣本直線相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料分析

ITP組與健康對照組相比性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）；血小板計數（Platelet，PLT）比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 ITP組與健康對照組臨床資料分析

2.2 CD4+CXCR3+T細胞表達率及IP-10、IFN-γ表達水平

ITP組CD4+CXCR3+T細胞表達率、IP-10、IFN-γ表達水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。完全反應組治療前CD4+CXCR3+T細胞表達率、IP-10、IFN-γ表達水平均明顯高于治療后及健康對照組（P＜0.05），且治療后與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。有效組治療前CD4+CXCR3+T細胞表達率、IP-10、IFN-γ表達水平均明顯高于治療后及健康對照組（P＜0.05），治療后IP-10、IFN-γ水平與健康對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 病例組及對照組中 CD4+CXCR3+T、IP-10、IFN-γ的表達

2.3 ITP組CD4+CXCR3+T細胞表達率與IP-10、IFN-γ水平、PLT相關性分析

ITP組中CD4+CXCR3+T細胞表達率與IP-10、IFN-γ表達水平均呈正相關（r1=0.293，P1=0.002，r2=0.248，P2=0.005）；IP-10與IFN-γ水平呈正相關（r=0.188，P=0.017）。CD4+CXCR3+T細胞表達率、IP-10、IFN-γ三者與PLT均沒有明顯相關性（P＞0.05）。見圖1。

圖1 ITP組CD4+CXCR3+T細胞表達率、IP-10、IFN-γ表達水平相關性分析

3 討 論

趨化軸由趨化因子、趨化因子受體及相關細胞因子構成，多途徑參與T細胞分化、分子粘附、白細胞遷移、細胞因子分泌和細胞凋亡調節等過程。CXCR3作為活化的T淋巴細胞特別是Th1和CD8+T細胞表面的標志物，是體內Th1細胞分化所必需的。CXCR3在Th1細胞向炎癥外周組織的運輸中起重要作用，被報道為Th1細胞極化的多種自身免疫性疾病（如多發性硬化癥、系統性紅斑狼瘡等）中的關鍵因子[5-6]。CXCR3存在三種特異性配體Mig、IP-10、I-TAC，均屬于IFN-γ誘導型趨化因子[7]。Groom等[8]通過小鼠模型證明IP-10是CXCR3三種配體中對Th1細胞的發育以及遷移過程最重要的趨化因子。有研究證明，新診斷的ITP患者中IP-10水平升高，當接受糖皮質激素治療或者脾切除病情緩解后，該值降至正常水平。Zhou等研究證明ITP患者脾臟中CXCR3的表達顯著增加，認為在患者脾臟中也存在Th1極化現象，CXCR3及其配體異常表達可能參與了ITP患者的脾臟免疫紊亂。IFN-γ是一種主要由Th1細胞分泌的糖蛋白。它可以參與并正向調節Th1細胞介導的免疫應答過程，同時抑制Th2細胞的發育[11]。體外實驗已證明使用IFN-γ誘導后多種類型細胞（如單核/巨噬細胞、內皮細胞、淋巴細胞、肝臟細胞等）可以表達IP-10，說明干擾素-γ是IP-10的生理誘導劑。

在本研究中，我們發現新診斷的ITP患者外周血中CX4+CXCR3+T細胞表達率、IP-10及 IFN-γ的表達水平均較健康對照組顯著增高，接受糖皮質激素治療1周后CX4+CXCR3+T細胞表達率、IP-10及 IFN-γ的表達水平較治療前下降，且與健康對照無明顯差異。因此在ITP患者外周血中，IP-10/CXCR3趨化軸相關因子均存在高表達，且IP-10、CXCR3、IFN-γ三者間呈正相關。以上結果印證了ITP中存在著Th1活化模式，IP-10/CXCR3趨化軸可能通過趨化機制在ITP免疫機制中發揮重要作用。此外，糖皮質激素可以糾正IP-10/CXCR3趨化軸異常表達，提示糖皮質激素可能是通過此種作用對ITP發揮治療作用。

目前，在一系列實驗及自身免疫性疾病中研究了IP-10/CXCR3趨化軸的靶向治療。在類風濕關節炎、心臟移植的小鼠疾病模型檢測到CXCR3表達升高，并且使用相應抗體可以減輕疾病表現。鑒于ITP患者外周血中IP-10/CXCR3趨化軸的表達變化及其在ITP發病機制中的作用，針對趨化軸的藥物干預及中和抗體或相應的受體拮抗劑的使用也許能成為治療Th1優勢型自身免疫性疾病的新方向。