小鼠胚胎移植影響因素的初步探索

桂 飛，楊偉偉，孫筱品，顧美兒

（杭州師范大學實驗動物中心，杭州 310036）

目前，轉基因小鼠品系已被廣泛應用，但在病原微生物控制、冷凍保種、品系復蘇和快速擴增繁殖等方面仍面臨很大的挑戰。其中，通過體外受精獲得大量胚胎，并采用胚胎移植方法成功植入受體雌鼠輸卵管，這是病原微生物控制和輔助生殖過程中不可或缺的一項技術[1]，既可以達到生物凈化的目的，有效控制病原微生物的感染[2-3]，同時也可以實現快速擴增繁殖，獲得大量子代小鼠。影響胚胎移植的因素有很多：一方面，不同品系之間的胚胎存在差異[4]，其中近交系胚胎更敏感，存活率更低[5]；另一方面，子宮承受能力也會影響移植成功率，包括單側或者雙側移植、移植胚胎數量等因素[6]。本研究基于本中心過去幾年的胚胎移植實驗數據，分析影響胚胎移植的主要因素，以期探索更加高效的實驗策略，為小鼠胚胎移植提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用APPSWE、SYN-a30p、Sox10-DTA、GFAP-creER、P53flox、ErbB2、MHC-cko、Sox10和Nrn1等277個基因修飾小鼠品系的雄鼠均由杭州師范大學醫學院和生命科學院邱猛生、張遵義、劉陽、陶艷梅、鞠振宇、劉俊平和楊磊等多個課題組提供，每個品系1～2只，8～12周齡。工具鼠：4周齡C57BL/6供體雌鼠，用于超數排卵，提供卵母細胞，每個品系5只；ICR結扎雄鼠150只，8～12周齡，用于與ICR受體雌鼠交配獲得假孕雌鼠；6～8周齡ICR假孕雌鼠，用于胚胎移植，每個品系3只。所有工具鼠均由杭州師范大學實驗動物中心提供[SCXK（浙）2016-0004]。所有小鼠均飼養于杭州師范大學實驗動物中心屏障環境中[SYXK（浙）2016-0006]，可以自由采食和飲水。待動物充分適應環境后，在符合動物福利倫理的條件下進行實驗，倫理審批編號為2019175。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）均購自寧波市三生藥業有限公司。苯巴比妥鈉購自福建閩東力捷訊藥業股份有限公司。M2培養液購自美國Thermo公司，精子獲能液TYH（Toyodo Yokojama and Hoshi）和人輸卵管培養液（human tubal fluid，HTF）等系本實驗室自制[7-8]。

1.3 主要儀器與設備

體式顯微鏡為日本Nikon公司產品。二氧化碳培養箱和生物安全柜為美國Thermo公司產品、超凈工作臺為蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司產品。恒溫熱臺為上海蔡康光學儀器有限公司產品，電子天平為德國Sartorius公司產品。移卵針為北京正天易科貿有限公司產品。吸卵管參照文獻[9]改良制作，其中所用橡膠軟管和0.22 μm過濾器均經過嚴格的消毒滅菌處理，將過濾器兩端連接橡膠軟管后，檢測氣密性良好即可使用。

1.4 胚胎收集

本研究所用277個基因修飾小鼠的背景品系均為C57BL/6，所以選用C57BL/6供體雌鼠進行超數排卵，腹腔注射一定劑量（5～10U/只）的PMSG，46～48 h后對應注射等量的hCG。12～14h后，以頸椎脫臼法處死供體雌鼠，切開腹部，取出輸卵管，從壺腹部分離取出卵丘卵母細胞復合體，置于HTF培養滴中，置于CO2體積分數為5%、37℃培養箱中孵育。

在生物安全柜中，以頸椎脫臼法處死雄鼠，切開腹部，暴露出雄鼠睪丸和附睪等組織，分離出附睪，刺破/剪破后取出精液，置于TYH培養滴中，置于CO2培養箱中孵育30～60 min。光學顯微鏡下觀察精子的活力和狀態，根據精子狀態，取適量的精子滴于孵育好的卵母細胞培養滴中，進行體外受精。

受精后4 h左右，更換培養液，清洗胚胎3次后，繼續放在CO2培養箱中培養至次日上午，于顯微鏡下挑選出成功受精的2-細胞胚胎，分選并統計數量，計算體外受精率。體外受精率＝受精后的2-細胞數/總卵母細胞數×100%。

1.5 胚胎移植

移植前1 d將ICR受體雌鼠與結扎雄鼠合籠處理，根據所需受體雌鼠數量，按照25%見栓率進行合籠。第二天早上進行檢栓操作，見栓的受體即為假孕雌鼠。

將假孕受體雌鼠麻醉，剃除腹部毛發，在此處剪開小口，用鑷子取出輸卵管，用止血夾夾住脂肪墊固定輸卵管位置。用嘴吸式移植針吸取2-細胞胚胎20枚，在體式顯微鏡下移植至單側或雙側輸卵管的壺腹部前段。移植完成后，縫合手術創口，置于恒溫熱臺，待受體雌鼠蘇醒后，再飼養于籠盒中。移植后14d，即可觀察移植受體雌鼠是否妊娠，妊娠率＝妊娠雌鼠數/移植受體雌鼠總數×100%。移植后19～21 d，小仔出生，即可統計窩產仔數和產仔率，窩產仔率＝窩產仔數/移植胚胎數×100%。由于胚胎不發生經子宮遷移，因此本實驗對比單側移植和雙側移植的效果，擬通過雙側移植的方法減輕子宮負荷。實驗分別將每個轉基因品系的胚胎單側移植20枚至受體雌鼠一側的輸卵管內，雙側移植則是在受體雌鼠的兩側輸卵管內分別移植入10枚同一品系胚胎，移植完成后縫合創口，置于熱臺待其蘇醒后單獨飼養，觀察小鼠妊娠及產仔情況。

1.6 統計學方法

運用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。277個品系分組后，每個品系至少移植3只受體鼠，結果數據以表示。使用卡方檢驗來分析體外受精率是否與妊娠率及窩產仔率相關。采用單因素方差分析和事后Tukey’s多重比較檢驗分析移植胚胎數和窩產仔數是否相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同受精率品系對移植后窩產仔率的影響

按照體外受精率不同，將277個品系分為0%～39%、40%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～100% 共 6組進行統計。結果（表1）發現，胚胎移植后各組間妊娠率沒有明顯差異（均P＞0.05）。體外受精率在0%～39%的品系窩產仔數（4.61±1.92）和產仔率（19.21%±9.70%）均顯著低于其他各組（均P＜0.01）；體外受精率在60%～69%的品系窩產仔率最高[（30.89±10.53）%]，而90%～100% 組[（25.57±9.36）%]比60%～69%組的窩產仔率明顯降低（P＜0.05）；其余各組間未見明顯差異（均P＞0.05）。結果表明，體外受精率低于40% 的品系胚胎移植后的產仔率明顯降低，平均每只受體產仔數也明顯減少。

表 1 不同受精率品系對移植后窩產仔率的影響Table 1 Effect of mouse strains with different fertility rate on the litter rate after transplantation(，n=3)

表 1 不同受精率品系對移植后窩產仔率的影響Table 1 Effect of mouse strains with different fertility rate on the litter rate after transplantation(，n=3)

注：#根據不同品系小鼠的體外受精率進行分組。與其他各組比較，**P<0.01；與60%～69%組比較，*P<0.05。

組 別# 品系/個 受精率/% 妊娠率/% 窩產仔數/只 產仔率/%0%～39%40%～59%60%～69%70%～79%80%～89%90%～100%18 20 29 51 106 53 21.87±12.13 51.53±5.74 66.07±2.68 75.31±3.00 85.06±2.95 93.58±2.68 84.35±21.08 (49/60)86.65±25.21 (38/60)79.82±29.84 (48/73)86.02±37.52 (86/154)84.73±23.31 (245/297)85.06±19.54 (97/151)4.61±1.92**6.70±2.11 7.14±1.78 6.55±2.03 6.17±1.71 6.06±1.60 19.21±9.70**28.46±12.98 30.89±10.53 28.26±13.46 26.32±11.57 25.57±9.36*

2.2 移植胚胎數量對窩產仔率的影響

不同數量胚胎的移植結果（表2）顯示，移植胚胎數較少（5枚）時，可以成功使受體妊娠，但是可能發出維持妊娠所必需的信號不足[10-11]，導致雌鼠母性較差，小仔出生后容易發生食仔的現象，小仔存活率較低。移植胚胎數在10枚以上時，各組窩產仔數和產仔率均較高；其中，胚胎移植數量在15枚左右時產仔率最高，達到（46.67±11.56）%，均明顯高于其他各組（均P＜0.01），表明此時胚胎利用率最大。移植數量達到25枚時，平均每只移植受體小鼠的產仔數最多（9.67±1.53），均明顯多于其他各組（均P＜0.01）。移植胚胎數繼續增加到30枚后，窩產仔數（8.33±0.58）和產仔率[（27.33±2.31）%]均有所下降，表明此時已超過小鼠子宮能承受的最大負荷。因此，移植胚胎數在15枚左右時利用率最大，移植胚胎數在25枚左右時獲得子代小鼠數量最多，此時子宮承載能力幾乎達到最大。

2.3 單側移植和雙側移植的比較

統計分析基因修飾品系Sox10的實驗結果，發現單側移植和雙側移植的窩產仔數分別為（4.75±0.96）只和（5.33±0.58）只，產仔率分別為（26.25±7.50）%和（26.67±2.88）%，單側移植和雙側移植之間無明顯差異（P＞0.05）。同時還對TLR4等多個品系進行了相應的實驗，發現單雙側移植的比較趨勢均與Sox10品系一致。

表 2 移植胚胎數量對窩產仔率的影響Table 2 Effect of the number of transfer red embryo on the litter rate(x- ± s，n=3)

3 討論

轉基因小鼠的背景品系比較復雜[10]，但大多采用C57BL/6品系。本研究中選用的277個小鼠品系的遺傳背景均為C57BL/6，研究發現這些品系的體外受精率不同對胚胎移植后受體妊娠率沒有明顯影響，但當受精率在40%以下時受體平均窩產仔數和產仔率均顯著降低，表明受精率較低的品系獲得的2-細胞胚胎質量也可能受到一定的影響，胚胎發育受阻，導致產仔率降低。體外受精率較低的品系，建議適當增加移植胚胎或受體的數量，以獲得足夠量的子代小鼠。另外，本研究還發現，不同品系之間存在一定的差異，大部分受精率低于40%的品系窩產仔數和產仔率均明顯降低，但極少數品系如Erf、Rosa-eGFP-DTA等的受精率較低，而胚胎移植后窩產仔率較高。目前，人們對造成這種現象的具體原因尚不清楚，有待進一步實驗研究。

本研究還發現，移植胚胎數較少（5枚）時，移植受體可以成功妊娠，但是由于出生小鼠數量較少，小仔出生后，容易發生食仔的現象，小仔存活率較低。Dorsch等[6]研究發現，移植胚胎數在3～5枚時，可使移植受體成功妊娠，與本研究結果相一致。另有文獻報道，胎盤只有在蛻膜化后才能維持妊娠，而小鼠和大鼠中只有囊胚存在時才發生妊娠，可能3～5個胚胎不足以發出維持妊娠所必需的信號[11-12]。然而這些研究報道仍不能解釋本研究中移植3～5枚即可發生妊娠的現象。

移植胚胎數在10枚以上時，各組窩產仔數和產仔率均較高。其中，胚胎移植數量在15枚左右時窩產仔率最高，達到（46.67±11.56）%，表明此時胚胎利用率最大。移植數量達到25枚時，平均每只移植受體小鼠的產仔數（9.67±1.53）最多。移植胚胎數繼續增加到30枚后，窩產仔數（8.33±0.58）和產仔率[（27.33±2.31）%]均有所下降，表明此時已超過小鼠子宮能承受的最大負荷。Dorsch等[6]研究表明，移植新鮮胚胎數在18～20枚時，移植效果最好；當移植胚胎數＞21枚時，窩產仔數和產仔率均會出現大幅下降，這與本研究結果有一定的差異。雌性小鼠共有5對乳房，故產仔數控制在10只以內，對小仔后續的生長發育比較有保障。Johnson等[13]提出一種“子宮容量”的觀點，他們認為子宮的容量超過一定極限后，就不能再維持胚胎的發育，這在一定程度上可解釋本實驗中發現的現象：當移植胚胎數達到30枚以上時，窩產仔數和產仔率均降低。

已有研究表明，胚胎不發生經子宮遷移[14]。因此，本實驗還對比了單側移植和雙側移植的效果，考慮采用雙側移植的方法減輕子宮負荷。然而分析結果表明，單側移植和雙側移植后的窩產仔數和產仔率均未見明顯差異。雙側移植需要在左右兩側均進行移植手術操作，較單側移植的操作難度大，對動物創傷也比較大，這可能會影響動物的妊娠率，故筆者建議采用單側移植即可。本實驗結果與Mahabir等[15]的研究結果相一致：單、雙側移植的效果未見顯著性差異。另外，需要說明的是，本實驗中部分品系的樣本量不足，無法將其一起統計，后續將進一步補充研究。