糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制
——基于生物信息學(xué)的初步探索

劉 旖

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137）

糖尿病腎病（DKD）是糖尿病患者常見并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致患者終末期腎病的主要原因。然而，盡管進(jìn)行了多年的研究，臨床尚無好的治愈辦法，原因之一在于許多與DKD密切相關(guān)的基因尚未被發(fā)現(xiàn)，不能從分子機(jī)制上闡明DKD的發(fā)病機(jī)制。因此，當(dāng)前研究迫切需要鑒定與DKD發(fā)育相關(guān)的基因，并闡明其分子機(jī)理。本研究的目的是利用GEO數(shù)據(jù)庫里的DKD、一般腎病和健康者的腎小球、腎小管組織的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)開展GSEA富集分析，分析差異基因表達(dá)譜，探討DKD的生物學(xué)通路，為DKD的精準(zhǔn)治療提供一定的分子依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本數(shù)據(jù)來源

在GEO數(shù)據(jù)庫中以關(guān)鍵詞“Diabetic Neuropathy”搜索發(fā)現(xiàn)GSE30122芯片數(shù)據(jù)為研究對象。該芯片包括69例研究對象，19例DKD患者（9例提供腎小球組織，10例提供腎小管組織），24例普通腎炎患者（13例提供腎小球組織，11例提供腎小管組織）和26例健康者（14例提供腎小球組織，12例提供腎小管組織），以研究對象腎臟活檢組織的RNA表達(dá)水平為分析數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對探針信號值進(jìn)行歸一化處理，若有多個(gè)探針對應(yīng)同個(gè)基因的，對信號值求取中位數(shù)作為唯一表達(dá)值。以Gene Symbol為依據(jù)，將探針轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.3 GESA富集分析

對RNA信號值進(jìn)行標(biāo)化處理，按照DKD、腎炎和正常組，用Hallmark庫進(jìn)行注釋，進(jìn)行GSEA富集分析，置換類型為gene sets，置換檢驗(yàn)次數(shù)為1000次，探索DKD在表達(dá)水平與哪些特定生物學(xué)意義的基因集有顯著關(guān)聯(lián)。以校正多重假設(shè)檢驗(yàn)值FDR＜0.25、標(biāo)化顯著性水準(zhǔn)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以歸一化富集得分（NES）大小為富集程度排序。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因

DKD組與正常組的比較里，共有13515個(gè)基因表達(dá)，其中6003（44.4%）個(gè)在DKD組顯著表達(dá)，信噪比值48.1%。與腎炎組相比，5927（43.9%）個(gè)基因在DKD組顯著表達(dá)，信噪比值46.1%。把表達(dá)數(shù)據(jù)按照活檢組織細(xì)分后，在腎小球組織的測序結(jié)果里，相比正常組，DKD組有8248（61.0%）個(gè)基因顯著表達(dá)；相比腎炎組，有7880（58.3%）個(gè)顯著表達(dá)的基因；在腎小管組織取材人群里，DKD組相比正常組、腎炎組分別有5684（42.1%）和5918（43.8%）個(gè)表達(dá)標(biāo)志物。

2.2 功能富集分析

對表達(dá)基因按照功能通路富集后，與正常組相比，有17個(gè)基因組在DKD組的富集滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，富集程度最大的前2個(gè)分別與免疫系統(tǒng)的編碼補(bǔ)體和移植排斥的表達(dá)上調(diào)功能有關(guān)（NES分別是2.03、2.02）（圖1）；與腎炎組相比，DKD有15個(gè)基因集上調(diào)表達(dá)，富集最高的2個(gè)基因集依然是移植排斥反應(yīng)（NES=1.99）和免疫補(bǔ)體（NES=1.89）。

本研究還發(fā)現(xiàn)，按活檢組織取材位置分組后，相當(dāng)于正常組，DKD組在腎小管的組織里有11個(gè)基因集顯著富集，其中最明顯的是涉及UV誘導(dǎo)反應(yīng)（NES=1.88）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（NES=1.82）的生理通路中上調(diào)；DKD組比腎炎組在IFNG（NES=1.81）和α干擾素蛋白反應(yīng)（NES=1.80）的通路里表達(dá)更高。而在腎小球組織里的功能富集沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

本研究通過GSEA富集分析已發(fā)表的GEO數(shù)據(jù)庫GSE30122中DKD患者、肺炎患者與正常人的活檢組織表達(dá)測序信息，利用hallmark數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)了17個(gè)基因集主要參與了的分子調(diào)控，在專門針對腎小管組織的測序里觀察到11個(gè)基因集參與了DKD的發(fā)生發(fā)展。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DKD的分子通路與免疫功能相關(guān)，其中，DKD富集程度最高的功能通路是補(bǔ)體系統(tǒng)。過往研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體系統(tǒng)是由30多個(gè)血漿以及細(xì)胞膜蛋白構(gòu)成的免疫體系，補(bǔ)體激活能產(chǎn)生C3/C5轉(zhuǎn)化酶并在激活過程中生成MAC，在這個(gè)過程中產(chǎn)生的凝集素、補(bǔ)體凝集素H-纖維膠凝蛋白、C3及其裂解片段、MAC等均有可能導(dǎo)致腎損害[1]。有研究發(fā)現(xiàn)論2型糖尿病患者C1q血清補(bǔ)體水平變化與腎功能降低獨(dú)立相關(guān)[2]。陳曉麗也指出，DKD的補(bǔ)體C3沉積陽性率較高，并且與病理等級正相關(guān)[3]。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活通過的途徑之一是MBL途徑，秦建華的研究發(fā)現(xiàn)，DKD組中單核細(xì)胞表面MBL補(bǔ)體CD59分子表達(dá)更高，說明MBL途徑對DKD的影響可能與單核細(xì)胞補(bǔ)體CD59的活化有關(guān)[4]。周新人[5]的研究指出糖尿病和DKD患者的尿C5a水平顯著高于正常人，C5a是血清補(bǔ)體C5激活過程中產(chǎn)生的炎癥驅(qū)化因子，也說明了DKD的發(fā)生發(fā)展與血清補(bǔ)體的激活過程有關(guān)。現(xiàn)有的研究[6]已經(jīng)觀察出人體的高血糖狀態(tài)可能直接或間接地激活補(bǔ)體，導(dǎo)致MAC，出現(xiàn)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，一旦這些過程發(fā)生在腎臟，就有可能導(dǎo)致DKD的出現(xiàn)。但是，以往關(guān)于這些功能分子與DKD的關(guān)系的研究大部分都是在動(dòng)物模型上和臨床樣本上進(jìn)行觀察，有待分子機(jī)制的闡明。作為補(bǔ)充，本研究從分子水平的角度出發(fā)，利用功能富集分析揭示了補(bǔ)體系統(tǒng)的信號通路在其中參與的可能性。此外，本研究還暗示了移植排斥系統(tǒng)、UV誘導(dǎo)反應(yīng)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等基因富集高的功能通路與DKD有關(guān)的可能性，而且這些可能涉及的分子機(jī)制不同于普通腎炎的分子機(jī)制，這有助于未來發(fā)掘更多的DKD獨(dú)立于腎炎的機(jī)制成因。

綜上，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，以智人研究的角度探討了DKD的成因，一定程度上從側(cè)面補(bǔ)充了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群觀察的研究論點(diǎn)，為今后的分子機(jī)制的研究方向提供一些參考，但這些推論還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明。