拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展及其在生物醫(yī)學領域中的應用

郭曉湲，排爾哈提·亞生，劉晨陽，鄭煒平，戴魯筠

(1. 浙江大學醫(yī)學院，浙江 杭州 310058; 2. 福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001; 3. 浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310058)

0 引言

細胞活動的動態(tài)過程涉及各種生物分子(例如蛋白質(zhì)，核酸和代謝產(chǎn)物)的構(gòu)象、 分布和相互作用的動態(tài)變化. 在生命科學研究中，使各種生化成分顯像是了解組織細胞生命活動的關鍵方法. 傳統(tǒng)的顯微技術(shù)包括光學顯微鏡明場觀察、 相差顯微術(shù)、 熒光顯微術(shù)等. 明場觀察和相差顯微術(shù)可無損地觀察細胞，但缺乏襯度和特異性； 熒光顯微術(shù)通過熒光發(fā)色團提供化學襯度，但熒光染料可干擾細胞正常代謝甚至殺死細胞.

疾病的發(fā)生和發(fā)展通常涉及生物分子的過量、 缺乏或功能異常. 監(jiān)測生物系統(tǒng)內(nèi)微環(huán)境的變化，可以更好地了解細胞生命過程和各種疾病的發(fā)病機制，并建立可靠且高度敏感的診斷方法. 而如何非侵入性評估組織的健康狀況變得至關重要. 拉曼光譜技術(shù)(以下也稱為“拉曼”)提供了無標記和非破壞性評估人體中細胞和組織功能的能力，具有對多種疾病輔助診斷的重要價值.

然而，傳統(tǒng)拉曼光譜技術(shù)存在信號強度低、 熒光干擾強等缺點，應用比較受限. 為克服這些缺點，隨之發(fā)展了許多新技術(shù)，包括表面增強拉曼散射(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)、 相干反斯托克斯拉曼光譜(coherent anti-Stokes Raman spectroscopy, CARS)、 受激拉曼光譜(stimulated Raman spectroscopy, SRS)、 共振拉曼光譜(resonance Raman spectroscopy, RRS)、 空間位移拉曼光譜(spatially offset Raman spectroscopy, SORS)等. 這些新技術(shù)的固有特點也使得其在生物醫(yī)學領域的特定研究中有著獨特優(yōu)勢和關鍵應用. 本研究將簡要概述拉曼光譜技術(shù)的原理，介紹為了增強和改善自發(fā)拉曼光譜信號而后續(xù)延伸出的技術(shù)，并了解其在生物醫(yī)學領域中的部分應用.

1 拉曼相關技術(shù)發(fā)展

1.1 傳統(tǒng)拉曼光譜技術(shù)

圖1 拉曼散射的原理Fig.1 Principle of Raman scattering

1928年，Raman等[1]在一次涉及光學的實驗中觀察到與原始入射波長不同波長的散射光. 這種現(xiàn)象被稱為“拉曼散射”，與瑞利散射不同，拉曼散射是一種非彈性散射, 即散射前后的光波長發(fā)生改變，其中波長增加的散射光稱為斯托克斯光，波長減少的散射光稱為反斯托克斯光. 入射光子和散射光子之間的能量差異對應于激發(fā)特定分子振動所需的能量(如圖1)，對這些散射光子進行檢測即可得到拉曼光譜. 不同的波段對應于不同官能團的振動頻率. 因此，根據(jù)分子的化學鍵及其特定的振動頻率，每個分子都有一個獨特的光譜，稱之為“指紋”[2].

拉曼光譜的優(yōu)點之一是能夠確定細胞的化學成分，其過程不需要標記或染色，根據(jù)細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)和DNA的振動光譜即可對這些物質(zhì)進行半定量分析，甚至對其在細胞內(nèi)的分布進行可視化. 然而，自發(fā)拉曼散射是一個強度較弱的過程，只有大約1×108個光子發(fā)生了非彈性散射[2]. 到了1940年, 拉曼光譜不再受到研究者們的重視，主要是因為拉曼效應太弱(約為入射光強的10-6)，研究者難以觀測拉曼散射信號, 進而無法測量研究二級以上的高階拉曼散射效應. 除此之外，要求被測樣品的體積必須足夠大、 無色、 無塵埃、 無熒光等. 20世紀60年代，紅寶石激光器的問世，使得拉曼散射的研究有了很大的進步. 由于激光器具有單色性能好，方向性能強，而且功率密度高等特點，所以用它作為激發(fā)光源，很大程度提高了激發(fā)效率.

1.2 表面增強拉曼光譜

圖2 表面增強拉曼光譜的原理[4]Fig.2 Principle of surface enhanced Raman spectroscopy[4]

1974年，F(xiàn)leischmann等[3]發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙化處理的銀表面上的吡啶分子產(chǎn)生的拉曼光譜信號比預期的強度高幾個數(shù)量級. 這種增強效應與特殊介質(zhì)的粗糙表面相關，其對應的光譜技術(shù)稱為表面增強拉曼光譜(SERS)技術(shù). 常用的介質(zhì)包括銀、 金、 銅等. 近年來，在解釋SERS的各種機制中，電磁增強(electromagnetic enhancement，EM)學說和化學增強(chemical enhancement，CM)學說是最為廣泛接受的兩種學說，如圖2所示[4]. 目前較為公認由范迪恩提出的EM機制在SERS增強中起主要作用，可以將拉曼光譜信號增強4～11個數(shù)量級[5]. 當入射激光撞擊金屬和導電界面時，電磁波可以驅(qū)動金屬納米顆粒(NP)的離域電子集體振蕩. 當入射光的頻率與金屬中自由電子的固有振蕩頻率匹配時，就會發(fā)生表面等離子共振(SPR). 共振頻率取決于粒子的大小、 形狀、 導電環(huán)境、 粒子的電子密度和有效電子質(zhì)量等. 在金屬納米結(jié)構(gòu)中，SPR可以高度定位在特定位置，稱為局部SPR(LSPR). LSPR將導致入射光的共振吸收或散射. 因此，入射光能可以有效地耦合到金屬納米粒子中，從而導致納米粒子表面局部電磁場強度提高[6]. CM是由報告分子(具有特征的振動且信號強度高的一類化學物質(zhì))和納米結(jié)構(gòu)之間的電荷轉(zhuǎn)移引起的，需要分子在金屬表面上直接吸附或化學結(jié)合，并且通常比EM弱[7].

SERS在醫(yī)學領域應用廣泛. 在細胞分子層面上其為DNA，為蛋白質(zhì)檢測提供了新的方法. SERS可以通過等離子體納米孔檢測DNA堿基，為DNA分析和新一代單分子測序平臺的新方法鋪平道路[8]. 作為一種無標記技術(shù)，SERS可快速監(jiān)測生物基質(zhì)中低濃度的物質(zhì)，使其成為對部分治療窗口狹窄藥物的高效實時檢測工具[9]. 由多重耐藥細菌引起的慢性感染可造成嚴重后果，對細菌感染性疾病進行監(jiān)測也是追蹤和驗證治療效果的必要條件. 使用SERS不僅可以檢測傷口表面細菌生長情況，也可在一定程度起到殺菌或抑菌作用[10].

近年來，SERS標簽結(jié)合激光拉曼光譜及顯微鏡技術(shù)在光學標記、 顯像上展現(xiàn)了獨特潛力. SERS標簽通常由附著有拉曼報告分子的金屬納米顆粒組成，這些分子發(fā)出強烈而獨特的拉曼信號. 通過結(jié)合特異性識別分子，SERS標簽可作為光學標記工具，用于對靶標生物分子的體外、 體內(nèi)間接檢測和成像. 與傳統(tǒng)的外部標記試劑(如有機染料、 熒光染料)相比，SERS標簽具有超高的靈敏度及高光穩(wěn)定性，僅需一個激光即可激發(fā)所有SERS標簽，最大限度地減少了來自細胞和組織的自發(fā)熒光[7, 11]. 癌癥手術(shù)期間無法完全切除腫瘤是致死性復發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因，然而術(shù)中準確界定腫瘤邊緣非常困難. SERS偽彩色成像系統(tǒng)利用SERS標簽可實現(xiàn)無創(chuàng)、 高效的組織分類判別，為外科手術(shù)領域帶來了新的變革[12].

1.3 相干拉曼散射

相干拉曼散射(coherent Raman scattering, CRS)是一種通過非線性光學過程誘導產(chǎn)生相干光的效應，該過程中目標分子特定的振動可作為成像所需的襯度，由此產(chǎn)生了一種新的光學顯微成像方法，即相干拉曼散射顯微術(shù). 相較于自發(fā)拉曼散射，相干拉曼散射光譜比自發(fā)拉曼光譜至少強3個數(shù)量級[13]，成像速度提高3～4個數(shù)量級. CRS技術(shù)通常使用高峰值功率、 高重復頻率的近紅外光作為激發(fā)光，生物樣品的吸收和散射較小，因而其對細胞的損傷也較低. 相干拉曼散射主要有相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)兩種，能級變化如圖3所示.

圖3 相干反斯托克斯拉曼散射、 受激拉曼散射的能級變化Fig.3 Energy level changes of coherent anti-Stokes Raman scattering and stimulated Raman scattering

1.3.1相干反斯托克斯拉曼散射

相干反斯托克斯拉曼光譜通過兩束光(ωp、ωs)來激發(fā)樣品，當這兩束入射光頻率之差與樣品某一化學鍵的振動頻率一致(Ω=ωp-ωs)且滿足一定的相位匹配條件即可發(fā)生共振產(chǎn)生相干的反斯托克斯光(ωas). 在這一共振過程中光譜信號得到加強，同時縮短了光譜采集時間、 降低熒光干擾，實現(xiàn)成像.

由于脂質(zhì)中 C—H 鍵數(shù)量多、 散射面大、 信號相對強，生物醫(yī)學領域中常通過CARS探測脂質(zhì)信號研究細胞的活動. 過去的研究常使用脂溶性染料對脂肪標記成像，但外源染料會影響細胞正常代謝，甚至造成不可逆損傷. 使用CARS能夠無標記、 無損害地對活細胞、 秀麗隱桿線蟲[14]等進行觀察. Xie課題組[15]對未染色成纖維細胞中的脂滴實現(xiàn)選擇性成像，與熒光染色結(jié)果的對照驗證了CARS的準確性. Le等[16]研究了腫瘤細胞在高脂環(huán)境中的行為，發(fā)現(xiàn)對于內(nèi)臟脂肪組織或血漿游離脂肪酸過多的小鼠，其循環(huán)血中的腫瘤細胞數(shù)量早期即明顯增多，并更易轉(zhuǎn)移. 通過CARS成像，研究者證實了在原發(fā)、 循環(huán)中和轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞中大量脂質(zhì)堆積，而過量的游離脂肪酸進入癌細胞可改變膜的特點，使腫瘤細胞侵襲能力增強. CARS也用于觀察細胞的遷移、 分化等過程[17-18]. 此外，CARS技術(shù)也可獲得細胞內(nèi)氨基酸、 核酸的成分信號[19]. Rajaofara等[20]使用CARS技術(shù)通過識別核仁、 核邊界、 染色體、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器結(jié)構(gòu)成功實現(xiàn)了對細胞周期的可視化研究.

利用CARS對目標分子特征的探測，可以無標記地對活體、 離體和病理組織切片成像, 輔助疾病診斷. 例如，CARS對含脂病變，如動脈粥樣硬化[21]、 神經(jīng)脫髓鞘改變[22]等尤為敏感. CARS也用于腫瘤組織探測，結(jié)合等雙光子激發(fā)熒光(TPEF)、 二次諧波(SHG)等非線性光學方法有助于對特異成分的顯像[23]. 隨著技術(shù)的發(fā)展，CARS內(nèi)窺鏡技術(shù)在臨床活體組織探查上也有著廣泛的發(fā)展前景[24].

1.3.2受激拉曼散射

受激拉曼散射原理與CARS類似，不同的是，SRS發(fā)生了光子與分子的能量轉(zhuǎn)移，再通過調(diào)制器解調(diào)即可提取信號，作為成像對比度來源. 與CARS技術(shù)相比，SRS成像技術(shù)特點在于：其一，CARS成像中可產(chǎn)生非共振背景，而SRS的激發(fā)必須嚴格滿足一定的共振條件，所以不會產(chǎn)生非共振背景； 其二，CARS成像時信號峰會發(fā)生移位，而SRS 光譜與自發(fā)拉曼散射光譜是完全一致的，故可直接利用拉曼光譜數(shù)據(jù)庫進行組分分析； 其三，SRS的信號強度與分子濃度呈線性正相關，使定量分析更加簡便.

圖4 受激拉曼組織學的應用Fig.4 Applications of stimulated Raman histology

同樣，利用SRS成像技術(shù)可對物質(zhì)進行選擇性成像，研究細胞的脂質(zhì)、 蛋白等信號，及細胞內(nèi)特定物質(zhì)的代謝和分布，如維甲酸[25]等. 近年來甚至發(fā)展了基于SRS的流式細胞術(shù)成像技術(shù)，較傳統(tǒng)熒光標記的流式細胞術(shù)避免了對細胞本身代謝的干擾[26]組織學上，使用SRS對鼠坐骨神經(jīng)髓鞘的脂質(zhì)成分的信號探測可以早期觀察肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的周圍神經(jīng)的退化[27]. 受激拉曼組織學對組織切片成像可以達到模擬HE染色的效果，甚至可實現(xiàn)小鼠術(shù)中腫瘤邊界探測[28]. 另有研究者利用SRS對腦腫瘤成像，結(jié)合深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡機器學習，能識別包括正常組織、 各中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的共13種組織類型，準確率達到94.6%，可與目前病理檢測媲美[29]，如圖4所示. 圖4(a)、 (b)為小鼠腦切片的SRS顯微成像、 HE染色成像對比[28]，左為SRS成像，脂質(zhì)顯像為綠色，蛋白質(zhì)顯像為藍色； 右為HE成像. 圖4(c)為一位膠質(zhì)母細胞瘤患者的腦切片SRS成像，紅色代表腫瘤區(qū)域，綠色代表非腫瘤區(qū)域，藍色表示非診斷區(qū)域[29].

為了提高信號識別的特異性，近年來拉曼標簽被廣泛應用于SRS中. 利用拉曼標簽具有的特異拉曼信號特征可以改變待測物質(zhì)原本的信號，從而在沒有細胞內(nèi)源物質(zhì)干擾的信號沉默區(qū)(1 800～2 800 cm-1)實現(xiàn)特異性檢測，同時不會對細胞本身代謝產(chǎn)生影響. 常用的拉曼標簽有氘、 炔烴等. 使用氘作為標記，可使C—H鍵的2 800～3 000 cm-1處信號轉(zhuǎn)移至C—D鍵的2 100～2 300 cm-1信號，有助于對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)的合成、 代謝研究[30-31]. 炔烴在2 125 cm-1附近有一特征性的拉曼峰，且該峰比C—D鍵高40倍. 炔烴可以在代謝過程中與包括核酸、 蛋白質(zhì)、 脂類和聚糖在內(nèi)的生物分子結(jié)合，因此利用受激拉曼散射(SRS)顯微鏡可對各種帶有炔烴標記的生物分子進行生物正交拉曼成像[32-33].

1.4 共振拉曼光譜

當激發(fā)光頻率接近或等于分子的一個電子吸收峰時, 部分特定的拉曼帶強度會急劇增加. 利用這一效應產(chǎn)生的技術(shù)稱為共振拉曼光譜(RRS)技術(shù). 相較于常規(guī)拉曼，RRS能將拉曼光譜信號增強4～6個數(shù)量級[34]，提高檢測靈敏度，縮短檢測時間. 其缺點在于，由于激發(fā)光子能量需與分子的電子躍遷頻率一致，一般在紫外光到可見光的范圍內(nèi)，需要頻率連續(xù)可調(diào)的激光器，以滿足各種分子最低允許的電子躍遷頻率； 此外，與常規(guī)拉曼相比，共振拉曼光譜的熒光背景更加顯著，其信噪比降低，譜帶易變形失真.

共振拉曼光譜選擇性地增強生物分子特定發(fā)色基團的振動，因而能對色素分子的進行非破壞性檢測，如番茄紅素、 類胡蘿卜素[35]、 葉綠素[36]、 血紅素[37-38]等. 相對于可見光激發(fā)，大部分蛋白質(zhì)等生物分子吸收位于紫外區(qū). 選擇紫外光提高了拉曼散射截面，且260 nm以下激發(fā)光沒有熒光干擾，可提高信噪比，因此，紫外共振拉曼光譜(ultraviolet resonance Raman，UVRR)在生物醫(yī)學研究中更具優(yōu)勢，現(xiàn)已用于實時定量生化反應監(jiān)測[39]、 體液低濃度抗生素檢測[40]、 生物分子結(jié)構(gòu)的特異性識別[41-43]等.

1.5 空間位移拉曼光譜

傳統(tǒng)的拉曼光譜分析方法僅能分析接近樣品表面的區(qū)域或分析透明包裝內(nèi)樣品的次表層組分，在應用上受到了限制. 2001年，Everall等[44]深入研究并闡述了拉曼散射光子遷移理論. 隨后，2005年Matousek等[45]在此理論基礎上提出了空間偏移拉曼光譜 (spatially offset Raman spectroscopy, SORS) 技術(shù)，從而實現(xiàn)了對數(shù)毫米深度內(nèi)，及不透明包裝內(nèi)材料的化學分析.

圖5 空間偏移拉曼光譜技術(shù)原理 Fig.5 Principle of spatially offset Raman spectroscopy

在SORS中，激光到達樣品內(nèi)部的不同深度ΔH所產(chǎn)生的散射光在返回表層后與激光光源入射點產(chǎn)生了偏移距離ΔS. 通過改變空間偏移距離ΔS的大小，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析處理方法即可獲得樣品內(nèi)部不同深度的拉曼光譜，如圖5所示. SORS技術(shù)除了具備傳統(tǒng)拉曼光譜的固有優(yōu)點外，還具有諸多獨特的優(yōu)點[46]：① 由于是偏移測量，結(jié)合光譜散射，可有效抑制熒光，提高檢測靈敏度； ② 在一定范圍內(nèi)，偏移距離越大，收集的拉曼信號中更深層樣品的信號越大，穿透深度越深，能夠?qū)崿F(xiàn)深層檢測； ③ 在檢測過程中可以不破壞包裝對樣品進行檢測，從而降低用戶的檢測和生產(chǎn)成本.

羅徹斯特大學光學研究所研究人員采用空間位移拉曼光譜無創(chuàng)檢測小鼠體內(nèi)骨骼強度[47]，并得出了體內(nèi)骨骼最大扭矩的估計值. Nicolson等[48]成功實現(xiàn)SORS技術(shù)與SERS的納米顆粒的結(jié)合，并成功檢測了15 mm深度的3D乳腺腫瘤模型[49]. 這些都揭示了SORS技術(shù)在醫(yī)學領域的獨特應用.

2 討論

綜上，近幾年來，拉曼光譜技術(shù)及其衍生發(fā)展而來的其他技術(shù)憑借其無創(chuàng)、 實時、 可重復性高等特點，在生物醫(yī)學方面，特別是在腫瘤的診斷、 治療、 預后等許多方面有了廣泛應用. 病理診斷是腫瘤診斷的金標準，而許多實驗研究已證明拉曼光譜對生物組織及其切片具有適用性. 然而，拉曼光譜要轉(zhuǎn)化為臨床工具，至少還必須具備以下幾項方面的支持：組織光譜數(shù)據(jù)庫、 分類方法、 用于診斷的統(tǒng)計模型等.

以下以結(jié)直腸癌為例討論不同拉曼技術(shù)具備的特點. 如前所述，傳統(tǒng)拉曼光譜技術(shù)中，散射光與入射光間的能量差異揭示了散射介質(zhì)中分子的振動及轉(zhuǎn)動狀態(tài)的變化，因此被稱為“指紋光譜”，但其散射強度較弱，應用有限. 使用表面增強拉曼光譜可增強分析物的拉曼散射效應. 由于其可將拉曼報告分子固定在納米顆粒上，與腸癌患者血液中生物標記物、 DNA結(jié)合，而為分子標記物的實驗室檢測提供更多的選擇. 然而其制備要求高，設備配置繁雜等缺點為表面增強拉曼光譜技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床工具帶來挑戰(zhàn). 共振拉曼光譜最大的優(yōu)勢對顯色基團的檢測非常靈敏，其可以用來研究蝦青素(蝦青素是一種在植物和海鮮中發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素，具有抗增殖、 抗氧化和抗癌的特性)在培養(yǎng)的結(jié)腸腺癌細胞中的分布，為抗腫瘤藥物研究提供了新的方向[50]. 已有證據(jù)表明，游離脂肪酸(FFAs)誘導的癌細胞膜變化可介導富含脂質(zhì)的腫瘤發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移. 受激拉曼光譜、 相干反斯托克拉曼光譜對于脂質(zhì)信號較為敏感，因此，推測其可用于無標記檢測早期癌癥轉(zhuǎn)移. 利用受激拉曼光譜、 相干反斯托克斯拉曼光譜的成像能力，可實現(xiàn)高度組織特異的成像效果，有助于區(qū)分腫瘤組織和正常組織，可為結(jié)直腸癌的邊界判斷、 術(shù)中切緣選擇提供依據(jù). 拉曼光子穿過介質(zhì)的路徑長度可以體現(xiàn)拉曼波段相對變化程度，即波段變化，從而編碼矩陣內(nèi)物體深度的信息. 空間位移拉曼光譜對深度光譜檢測較為有效，其具備協(xié)助診斷體內(nèi)腫瘤病變深度的能力，從而在確定腫瘤分期、 決定后續(xù)治療方面具有應用前景. 各種拉曼光譜技術(shù)的比較如表1所示.

表1 不同拉曼光譜技術(shù)比較

3 結(jié)語與展望

自1928年Raman發(fā)現(xiàn)拉曼效應以來，拉曼光譜就成為檢測分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段. 拉曼光譜技術(shù)是一種檢測分子振動以表征樣品潛在化學結(jié)構(gòu)的光譜技術(shù). 傳統(tǒng)的拉曼光譜強度弱、 存在一定的熒光干擾，而新的拉曼技術(shù)的不斷發(fā)展改進了上述缺點，大大拓寬了其應用范圍.

目前，拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)成為一種多功能的生物醫(yī)學分析工具. 單細胞拉曼光譜通常包含上千個拉曼光譜帶，可以提供豐富的細胞分子信息，例如核酸、 蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)等，并可反映細胞的基因型、 表型和生理狀態(tài)[51]. 而阻礙其發(fā)展的有“兩座大山”：其一為被認為拉曼光譜生理缺陷的“信號強度低”； 其二為由于振動模式接近的生物分子造成的“重疊的光譜帶[52]”. 為了跨過“第一座大山”，可以運用表面增強拉曼光譜等技術(shù)實現(xiàn)信號增強； 而要跨過“第二座大山”，可以運用拉曼探針等技術(shù)實現(xiàn)分子的特異性檢測. 拉曼光譜在分子水平上對細胞和組織進行無標記的化學定量和空間分布評估，證明了拉曼顯微成像在細胞病理學和組織病理學中的潛力，并已應用于細胞代謝的動態(tài)觀察、 細胞特征和分類、 疾病的診斷和檢測、 三維成像等.

目前，拉曼光譜仍有一定的改進空間和巨大的發(fā)展前景. 在技術(shù)上可進一步提高的方向包括改進激發(fā)光源、 提高靈敏度、 縮短圖像采集時間等； 在應用方面，發(fā)展自動成像成為專用的顯微技術(shù)，與其他成像方式的結(jié)合優(yōu)化成像，形成基于拉曼數(shù)據(jù)的細胞和組織診斷的客觀分類程序，與人工智能結(jié)合進一步提高診斷準確率等. 隨著拉曼技術(shù)的不斷發(fā)展，未來拉曼光譜將在科學研究的各領域得到更加廣泛的應用.