INMT基因在肝癌中的表達及其機制研究

劉新會 羅越 林俊豪 莊雪芬 魏莉

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率在全球癌癥中居第5位，死亡率居第2位，每年可導致近700 000人死亡，嚴重威脅著人類的健康[1]，而其中超過50%的病例發生在我國，最新的流行病學研究發現肝癌已經居我國60歲以下男性惡性腫瘤發病的首位[2-3]，因此深入探究肝癌的發病機制，尋找其潛在的診斷和治療靶點尤為重要。吲哚胺N-甲基轉移酶（indolethylamine N-methyl－transferase，INMT）是甲基化的催化劑，主要與大腦活動相關[4]。近年來研究認為INMT與腫瘤的發生、發展相關，INMT在多種惡性腫瘤中均表達下調[5-7]。但INMT在肝癌中的表達和臨床意義尚未見報道，其在肝癌中的作用及其機制仍不明確。癌癥相關數據庫（TCGA和GEO）可以通過對肝癌大樣本的數據分析，為INMT基因在肝癌發生、發展中作用機制的深入研究提供客觀依據。本研究采用TCGA肝癌數據庫和肝癌基因芯片GSE102079，旨在應用生物信息學分析探討INMT在肝癌發生、發展中的作用及可能的機制，為肝癌的防治提供生物信息學依據。

1 材料和方法

1.1 肝癌數據庫來源 本研究從TCGA（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structuralgenomics/tcga,TCGA-LIHC）[8]下載肝癌RNA測序數據庫及患者臨床資料，包含371例肝癌患者的癌組織以及50例肝癌患者的癌旁組織。GSE102079肝癌基因芯片數據從 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載[9]，芯片共包含152例肝癌患者的癌組織和91例肝癌患者的癌旁組織。

1.2 INMT在肝癌數據庫的表達分析 采用R語言分析TCGA數據庫中INMT在癌組織和癌旁組織的表達情況，同時分析在GSE102079中INMT在肝癌組織和癌旁組織的表達差異，并采用Graphpad進行統計學分析和繪圖。

1.3 INMT表達與肝癌患者的生存分析 采用Kaplan-Meier Plotter數據庫分析[10]，其中收錄了肝癌患者總生存期（overall survival,OS）、無進展生存期（progress free survival,PFS）和目的基因的表達信息，在數據庫中設置條件：Gene：INMT；Split patients by：Auto select best cutoff，分析數據庫內INMT表達與肝癌患者OS和PFS的關系。

1.4 INMT相關基因的富集分析 采用R語言分析TCGA中INMT的相關基因，結果發現和INMT顯著相關的基因303個。采用R語言分析GSE102079中INMT的相關基因，結果發現和INMT顯著相關的基因421個。其中178個基因同時在兩個數據庫中為INMT相關基因（INMT-related genes,IRGS）。采用 DAVID（the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，http://david.abcc.ncifcrf.gov/）[11]在線分析數據庫對IRGs進行KEGG通路[12]和GO通路[13]富集分析。

1.5 INMT相關基因的蛋白網絡構建 STRING數據庫是分析基因或蛋白相互作用的在線檢索工具，將IRGS導入數據庫，進一步構建INMT相關基因的蛋白網絡，提供INMT相關蛋白的相互作用分析。

2 結果

2.1 INMT在肝癌組織和癌旁組織中的表達比較 TCGA數據庫顯示，INMT在肝癌組織中表達顯著低于癌旁組織（P＜0.01，圖1a）；進一步分析發現，和50例配對癌旁組織相比較，肝癌患者的癌組織中INMT仍然顯著低表達（P＜0.01，圖1b）。為了在不同肝癌數據庫中驗證INMT的表達，筆者對肝癌基因芯片GSE102079進行數據分析，結果顯示和癌旁組織相比較，INMT在肝癌組織中的表達顯著降低（P＜0.01，圖1c），這提示INMT可能在肝癌中發揮抑癌基因作用。

2.2 INMT基因高表達與肝癌患者預后的相關性分析為明確INMT基因能否作為肝癌患者預后的分子標志物，筆者采用Kaplan-Meier Plotter數據庫分析INMT基因表達與肝癌患者生存期的關系，結果發現和INMT基因低表達組（110例）相比較，INMT基因高表達組（254例）OS顯著延長（P＜0.01，圖 2a）；和 INMT基因低表達組（176例）相比較，INMT基因高表達組（194例）PFS也顯著延長（P＜0.01，圖2b）。這提示INMT基因高表達可能作為肝癌患者預后較好的標志物。

圖1 INMT在不同肝癌數據庫中表達（a：TGCA肝癌數據庫；b：TCGA配對肝癌數據庫；c：GSE102079肝癌數據庫；**P＜0.01；INMT為吲哚胺N-甲基轉移酶）

圖2 INMT高表達和低表達肝癌患者的總生存期和無進展生存期比較（a：總生存期；b：無進展生存期；INMT為吲哚胺N-甲基轉移酶）

2.3 INMT在肝癌中發揮抑癌基因作用的分子機制研究 為進一步研究INMT在肝癌中發揮抑癌作用的分子機制，筆者分析發現TCGA和GSE102079中有178個INMT相關基因（IRGs）重疊（圖3a）。KEGG通路富集分析表明，IRGS主要涉及PI3K-AKT信號通路、細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、腫瘤信號通路等（圖3b）；GO通路富集分析發現，IRGs主要涉及細胞外基質組成、細胞黏附、血管形成等生物過程，細胞學組成分析顯示這些基因參與細胞外基質、細胞基底膜、細胞外泌體等的組成（圖3c）。分子功能的變化主要涉及結合肝素、膠原、鈣、整合素等，還參與細胞外基質結構等。

2.4 構建肝癌中INMT相關基因的蛋白相互作用網絡采用STRING構建INMT相關基因的蛋白相互作用網絡（圖 4），發現 COL14A1、FBLN1/2、PECAM1、EMCN、FLT4等在INMT相關基因的蛋白相互作用網絡中發揮關鍵作用（圖5）。采用STRING構建的INMT相關基因的蛋白相互作用網絡為進一步探討INMT在肝癌中發揮作用的機制研究提供生物信息學依據。

3 討論

肝癌早期診斷具有一定的難度，大多數肝癌患者就診時已是中晚期，已經失去根治性治療機會，病死率一直居高不下，且世界范圍內超過50%的病例發生在我國，因此深入探究肝癌的發病機制，探索肝癌早期腫瘤標志物具有重要的臨床意義[14]。INMT和腫瘤發生、發展相關，研究發現INMT在多種惡性腫瘤中均表達下調[5-7，15-16]。但INMT在肝癌中的表達和臨床意義尚鮮見報道，其在肝癌中的作用及其機制仍不明確。本研究分析了肝癌TCGA和GEO數據庫，發現和肝癌患者的癌旁組織相比較，癌組織中INMT表達顯著下降，這和INMT在前列腺癌、肺癌、胃癌中表達下調一致，說明INMT可能在多種惡性腫瘤中發揮抑癌基因的作用，并進一步為INMT基因在肝癌中的深入研究提供依據。

目前INMT基因在肝癌中的表達及與預后的關系尚不明確，而且INMT在腫瘤中發揮抑癌作用的機制仍缺乏深入研究。本研究進一步分析發現INMT高表達肝癌患者的OS和PFS顯著延長，這表明INMT基因高表達可能作為肝癌患者預后較好的標志物，可能在肝癌中發揮抑癌基因作用。進一步對兩個肝癌數據庫中的INMT顯著相關基因進行分析，篩選出178個重疊基因（IRGs）。為了進一步了解INMT相關基因，筆者對重疊基因進行進一步的KEGG和GO通路富集分析，發現IRGS主要涉及PI3K-AKT信號通路、細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、腫瘤信號通路等；生物過程變化主要有細胞外基質組成、細胞黏附、血管形成等生物過程，細胞學組成分析顯示這些基因參與細胞外基質、細胞基底膜、細胞外泌體等的組成。分子功能的變化主要涉及結合肝素、膠原、鈣、整合素等，還參與細胞外基質結構等。PI3K-AKT信號通路在肝癌發生、發展中發揮重要作用，其可能通過促進肝癌細胞增殖、侵襲和轉移發揮促癌基因作用[17-19]。而細胞外基質以及黏附分子等也參與肝癌侵襲轉移等過程[20-21]。這提示INMT可能通過參與PI3K-AKT信號通路或調控細胞外基質以及黏附分子表達在肝癌中發揮抑癌基因作用，這為進一步探討INMT在肝癌中的作用機制提供了初步思路。

圖3 在肝癌中與INMT表達相關的基因富集分析（a：TCGA和GSE102079數據庫中INMT相關基因重疊的Venn圖；b-c：INMT相關基因的KEGG和GO富集分析；INMT為吲哚胺N-甲基轉移酶）

除此之外，筆者采用STRING構建了肝癌中INMT相關基因的蛋白相互作用網絡，發現COL14A1、FBLN1/2、PECAM1、EMCN、FLT4等在INMT相關基因的蛋白相互作用網絡中發揮關鍵作用。COL14A1是細胞外基質的重要組成成分，而且和腫瘤進展和轉移相關。研究表明COL14A1可以顯著抑制食管癌患者的增殖和侵襲從而發揮抑癌基因作用[22-23]。筆者研究亦發現在肝癌中INMT和COL14A1表達呈顯著正相關。研究表明FBLN1/2、PECAM1、EMCN都是血管內皮的重要黏附分子，參與腫瘤的血管生存和侵襲轉移[24-26]。本研究中，筆者發現在肝癌中INMT表達和FBLN1/2、PECAM1、EMCN呈正相關，說明INMT可能通過調控肝癌微環境中黏附分子的表達，從而參與腫瘤血管形成和發生、發展。采用STRING構建INMT相關基因的蛋白相互作用網絡為進一步探討INMT在肝癌中發揮作用的機制研究提供生物信息學依據。

綜上所述，在本研究中，筆者發現INMT在肝癌組織中顯著低表達，INMT高表達與肝癌患者預后較好相關，可能在肝癌中發揮抑癌基因作用，INMT可以作為肝癌早期診斷和預后的一個治療靶點。此外，通過富集分析和STRING構建INMT蛋白互作網絡初步探討了INMT在肝癌發揮作用的潛在機制。為深入探討INMT在肝癌中發揮抑癌基因的具體分子機制，還需要進行一系列的實驗來驗證本研究團隊的預測結果。

圖4 INMT相關基因的蛋白相互作用網絡（INMT為吲哚胺N-甲基轉移酶）

圖5 TCGA-LIHC 肝癌數據庫中各基因與 INMT 相關性分析（a：COL14A1；b：FBLN1；c：FBLN2；d：PECAM1；e：EMCN；f：FLT4；INMT 為吲哚胺N-甲基轉移酶）