miR-100-5p用于肝癌患者預后判斷的臨床意義分析

何興楨 潘翔 鄭培奮

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其預后較差，嚴重威脅我國人口的健康[1-2]。HCC早期癥狀不典型，起病隱匿，且具有高惡性程度、高復發、高轉移率等特點，因此盡管目前對于HCC的治療方法逐漸增多，包括手術治療、介入治療、放化療及靶向治療等[3]，但HCC患者預后仍不理想。因此，如果能夠發現HCC早期診斷、治療以及預后相關的生物標志物，將對臨床診療有重要的意義。

隨著大數據時代的到來，目前生物信息學在腫瘤中的應用越來越廣，通過生物信息學分析尋找HCC中異常表達的基因，可為尋找HCC的生物標志物提供依據。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，由于miRNA在組織、血漿中可穩定存在，并在腫瘤組織中存在異常表達，且可調控腫瘤細胞增殖、轉移、凋亡等細胞學進程，是可選的生物標志物之一[4-5]。miR-100-5p作為miRNA家族的一員，在膀胱癌、神經膠質母細胞瘤等腫瘤中均存在異常表達，并和疾病分期及預后相關[6-7]。而在HCC中，有學者發現miR-100-5p表達水平低于正常肝臟組織，與患者預后相關，且過表達miR-100-5p可抑制HCC進展[8-9]。為進一步明確miR-100-5p在HCC患者預后中的臨床意義，本研究通過生物信息學分析及組織標本表達檢測，評估miR-100-5p用于不同臨床特征HCC患者預后監測的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2004年1月至2013年12月于浙江醫院就診的HCC患者118例，其中男77例，女41例，年齡 21～79（50.29±14.00）歲。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）患者需經病理確診為HCC（診斷依據為2010版AJCC癌癥分期手冊），有完整的臨床數據及隨訪信息；（3）患者不存在其他原發腫瘤相關疾病。末次隨訪時間為2018年12月，所有患者均知情同意，本研究經浙江醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 Trizol、逆轉錄試劑盒以及SYBRGreen PCR kit試劑盒均購自中國賽默飛世爾科技有限公司；miR-100-5p前引物購自中國上海吉馬生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 獲取HCC石蠟組織塊，按說明書方法使用Trizol提取標本中總RNA，并測定提取得到的總RNA濃度，以1 μg總RNA為底物，在普通PCR儀上進行逆轉錄。采用逆轉錄試劑盒進行反轉錄，獲取cDNA。反應條件：37℃，60 min；95℃，5 min。以cDNA為模板，使用miScript SYBR-Green PCR kit試劑盒進行RT-qPCR檢測。RT-qPCR所用引物如下：miR-100-5p前引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAACCCGTAGATCCGA-3′，后引物：通用引物。內參U6前引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；后引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應體系：模板cDNA1μl，miR-100-5p上游引物1 μl，10*miScript通用引物 2 μl，2*Quanti TectS YBR Green PCR Master Mix 10 μl，加無酶水至總反應體積20 μl。反應條件：95 ℃，15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70℃，30 s；共計40個循環。

1.4 TCGA數據庫驗證 TCGA數據庫（www.cancergenome.nih.gov）中可獲取HCC患者預后數據，通過數據庫中患者預后信息和miR-100-5p表達水平繪制生存曲線，以miR-100-5p表達水平中位數為界，將患者分為miR-100-5p低表達組和高表達組。采用log-rank檢驗進一步驗證miR-100-5p和HCC患者預后的相關性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier分析和log-Rank檢驗繪制生存曲線；采用單變量和多變量Cox回歸分析miR-100-5p和患者預后的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織miR-100-5p低表達、高表達與臨床特征的關系 miR-100-5p低表達、高表達與臨床分期有關，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤長徑無關，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 HCC組織miR-100-5p表達和患者預后的關系對影響HCC預后的相關臨床因素進行單因素和多因素分析，結果顯示腫瘤高分期和miR-100-5p低表達是HCC預后的獨立危險因素（均P＜0.05），其HR值及95%CI分別為 0.269（0.138～0.523）、2.569（1.277～5.169），見表 2。

miR-100-5p低表達組預后生存率明顯低于高表達組患者（P＜0.01，圖1a），這和TCGA數據庫中的預測的結果相同（P＜0.01，圖1c）。且高分期（Ⅲ+Ⅳ期）HCC患者預后生存率低于低分期（Ⅰ+Ⅱ期）組（P＜0.01，圖1b）。并且在不同亞組中miR-100-5p表達水平與HCC預后關系各不相同，其中在高分期（圖2b）、低齡（≤60歲）（圖 2c）、男性（圖 2e）、小組織（腫瘤長徑≤5 cm）組（圖2g）中，低表達miR-100-5p患者的生存時間更短差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而在低分期（圖2a）、高齡（＞60歲）（圖2d）、女性（圖 2f）、大組織（腫瘤長徑＞5 cm）組（圖2h）中均未發現相關性（均P＞0.05）。另外，在大組織、女性亞組中miR-100-5p高表達和低表達組可觀察到不同預后趨勢，雖然差異均無統計學意義（均P＞0.05），但不能排除樣本量過少所致偏倚，需擴大樣本量后進一步驗證。

表1 HCC組織miR-100-5p低表達、高表達與臨床特征的關系（例）

表2 HCC組織miR-100-5p表達與患者預后關系分析

圖1 miR-100-5p表達及腫瘤分期與患者預后生存的關系（a：石蠟標本miR-100-5p低、高表達患者預后分析；b：石蠟標本不同分期肝細胞癌患者預后分析；c：TCGA數據庫中miR-100-5p低、高表達患者預后分析）

3 討論

HCC作為常見的惡性腫瘤，其惡性程度高、預后差，對國民的生命健康產生了巨大的威脅。因此，提高HCC的診斷與治療水平有著重要的臨床意義。近年來HCC相關研究發現了越來越多新的生物標志物，但并無哪個標志物是完全理想的。目前，miRNA分子在HCC中的作用機制和臨床意義被許多學者所關注，多種miRNA（如miR-217、miR-148a、miR-17等[10-12]）被發現在HCC組織中異常表達，并和HCC發生、發展相關。另外，miRNA分子在體外相對穩定，且易于檢測，有作為生物標志物應用于HCC診斷、預后判斷的可能。研究發現，miR-215、miR-150、miR-99a 等[13-15]miRNA 在 HCC組織中表達降低，miR-96、miR-155、miR-106b-5p等[14，16]在HCC組織中表達升高，這些在患者血漿或組織中異常表達的miRNA和患者臨床分期相關，這將可能用于HCC的早期診斷或靶向治療，并對判斷腫瘤的惡性程度和預后有著一定的臨床意義。

近年來，多項研究發現miR-100-5p在腫瘤中存在異常表達，并具有一定臨床意義。如在口腔鱗狀細胞癌中，低表達miR-100-5p提示患者預后較差[17]。在非肌層浸潤膀胱癌組織中，miR-100-5p低表達組的膀胱癌患者無疾病進展時間和腫瘤特異生存時間明顯長于高表達組，具有臨床意義[6]。在神經膠質母細胞瘤中，血清miR-100-5p低表達患者預后生存時間明顯低于高表達患者，這表明miR-100-5p可用于判斷患者的預后[7]。

圖2 各個不同亞組miR-100-5p表達與患者總體預后生存的關系（a：低分期亞組；b:高分期亞組；c：低齡亞組；d：高齡亞組；e：男性亞組；f：女性亞組；g：小組織亞組；h：大組織亞組）

在HCC中，已有關于miR-100功能或臨床意義的相關報道。Ge等[8]研究發現，過表達miR-100可通過抑制HCC細胞自噬誘導細胞凋亡以及抑制HCC細胞的增殖。另一項研究發現，miR-100和miR-125b可通過抑制血管生存從而抑制HCC的轉移[18]。以上研究均表明，miR-100可能作為HCC靶向治療的靶點之一。

前期已有Chen等[9]研究發現，miR-100在HCC組織中表達降低，且是HCC預后的獨立危險因素。本研究通過石蠟標本檢測miR-100-5p在HCC組織中的表達，并分析其表達水平和患者臨床特征間的相關性。結果發現低表達miR-100-5p和HCC較高的臨床分期具有相關性，且低表達miR-100-5p患者預后較差，該結果與TCGA數據庫分析結果一致。進一步的亞組分析結果顯示，該結論在高分期、低齡、男性、腫瘤組織≤5 cm患者中依然適用。在低分期、高齡、女性、大組織亞組中，miR-100-5p表達和患者預后并無相關性。

綜上所述，本研究通過樣本檢測及TCGA數據庫分析發現，HCC組織miR-100-5p表達水平可用于預測HCC患者預后。miR-100-5p低表達是HCC患者預后較差的獨立危險因素。在高分期、低齡、男性、腫瘤組織≤5 cm HCC患者，miR-100-5p低表達提示著較差的預后，在女性、腫瘤組織＞5 cm HCC患者中miR-100-5p的臨床意義有待進一步驗證。