基于網絡藥理學的抗骨痹方治療多發性骨髓瘤的作用機制研究

張林 謝穎 李鑫 陳洪雨

多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）[1-2]是由骨髓中終末分化的漿細胞克隆擴增所引起的血液惡性腫瘤，可導致體內多器官發生損害，患者最終出現骨痛、骨質破壞、腎功能不全、高鈣血癥以及造血功能抑制所致的貧血、易感染等一系列臨床表現。MM中醫屬“骨痹”、“虛勞”、“骨蝕”等范疇。大量臨床實驗表明，雖然傳統方法如化療等明顯提高了治愈率，但仍存在不同程度的不良反應、毒副反應、耐藥性及易復發等缺點[3-7]。

抗骨痹方是紹興市人民醫院在祖國傳統醫學中有關醫治“骨痹”、“骨蝕”等疾病過程中總結的自擬方，在臨床上療效明顯，該方與傳統的化療方案對比有一定的優勢，組方中主要的4味中藥為白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇和蚤休。其中白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、增強免疫的作用；半枝蓮除清熱解毒和抗炎作用外，還被廣泛應用于多種惡性腫瘤的治療；山慈菇具有清熱解毒，消癰散結等功效；蚤休可治癰腫、肺癆久咳、跌打損傷、蛇蟲咬傷、淋巴結核、骨髓炎等疾病，近年來發現其有抗癌功效。本研究擬采用網絡藥理學[8]的方法研究抗骨痹方中主要4味中藥在治療MM中的主要靶點和通路，以期為未來深入研究并驗證其相關機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 活性成分篩選和靶點預測 通過中藥系統藥理數據庫及分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）對白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、蚤休的化學成分進行收集?；赥CMSP數據庫中的吸收、分布、代謝和排泄（absorption,distribution,metabolism and excretion,ADME）參數進行篩選（篩選規則：口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18），篩選出活性成分。獲得大量的活性成分后將化學成分信息在線提交到中藥分子機制的生物信息學分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional chinese medicine,BATMAN-TCM） 數據庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），并選擇可信度較高的蛋白作為預測靶點（Score cutoff＞20）。將檢索得到的靶點使用Uniprot數據庫轉化為統一名稱。經上述操作后獲得與活性成分相關的靶點信息。

1.2 MM相關基因收集 通過DisGeNET數據庫（https://www.disgenet.org/）收集MM相關基因。

1.3 網絡構建和分析 將4種單味藥的活性成分作用靶點與疾病相關靶點做映射，得到兩者共同作用靶點。采用Cytoscape軟件構建：（1）成分-靶點網絡，如果某一蛋白是化合物作用的靶點，則它們之間進行網絡連接；（2）使用互作基因/蛋白質檢索的搜索工具數據庫（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING）（https://string-db.org/） 構建靶點的蛋白-蛋白相互作用網絡（protein-protein interactions,PPI）。

1.4 PPI網絡的分析 將PPI網絡進行網絡拓撲結構分析和聚類分析。網絡拓撲結構分析運用Cytoscape軟件中的工具Network Analyzer來計算自由度degree和介數（Edge Betweenness）這兩個重要的網絡拓撲參數，并設定拓撲參數的閾值從PPI網絡中篩選出Hub基因。網絡聚類分析使用軟件Cytoscape的插件ClusterONE（ClusterONE算法可以主要解決的是蛋白質復合物的類別識別問題，也就是PPI網絡中密集子結構的識別問題。ClusterONE算法中，內聚力得分越高則代表了該組蛋白質越有可能是一種蛋白質復合物）來處理。

1.5 通路富集分析 采用Cytoscape插件ClueGO對Hub基因進行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析（設定閾值 P＜0.05）。

2 結果

2.1 抗骨痹方活性成分以及靶點信息的篩選結果 通過TCMSP和BATMAN數據庫獲得白花蛇舌草的活性成分有7個，半枝蓮29個，山慈菇3個，蚤休4個，見表1。

表1 抗骨痹方活性成分的信息

2.2 成分-靶點網絡圖和PPI網絡圖的構建 將獲得的抗骨痹方主要成分的活性成分和映射得到的靶點信息導入Cytoscape，構建活性成分-靶點網絡圖（圖1、2）。其中棱形節點代表中藥的活性成分，圓形節點代表靶點蛋白。其中不同顏色代表節點的自由度（Degree）不同，顏色從黃到紅，自由度依次增大。自由度越大，說明節點在網絡中的重要程度越大?；钚猿煞?靶點網絡圖反映了中藥成分與靶點蛋白關系的重要性。

將映射得到的靶點蛋白在線輸入STRING數據庫，構建白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、蚤休的蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）（圖3），不同顏色的圓形節點代表著不同的靶點蛋白，連線表示蛋白與蛋白之間的相互聯系。

圖1 4味中藥的單獨成分-靶點網絡圖（a：白花蛇舌草；b：半枝蓮；c：山慈菇；d：蚤休）

圖2 4味中藥的總成分-靶點網絡圖

圖3 蛋白-蛋白相互作用網絡

2.3 網絡拓撲和聚類分析 采用Cytoscape中的Network analysis工具對PPI網絡進行拓撲結構分析，提交到BATAMN數據庫后獲得可信度較高（Score cutoff＞20）的蛋白靶點信息，并與疾病靶點映射后得到映射靶點，篩選出Hub基因（自由度＞均值）共12個，見表2。其中自由度最高的是AKT1和PIK3CG，自由度均為19，表示這兩者均能與19個蛋白產生相互作用，在整個蛋白網絡中起著關鍵作用。

表2 Hub基因信息

此外采用了ClusterONE算法對PPI網絡進行了聚類分析，結果顯示size≥3的模塊有6類，模塊參數見表3。

表3 映射靶點的聚類分析

采用Cytoscape插件ClueGO，對篩選出的Hub基因進行KEGG通路富集（圖4、5，插頁）分析。結果以基因和通路相聯系的網絡圖以及柱狀圖呈現4味藥治療MM的作用機制。網絡圖中，顏色相同的節點表示Kappa Score值相同，帶有紅色標簽的節點為基因，連線表示兩者之間有相互作用的關系；柱狀圖上的數字表示相關基因的個數，橫坐標表示的是進行分析的與每個term相關的基因個數占與每個term相關總基因個數的比例，柱狀圖的左邊為每個term的全稱，數字表示進行分析的基因與term相關的個數。

圖4 KEGG通路富集分析網絡圖

圖5 KEGG通路富集分析柱狀圖

3 討論

MM 屬中醫“骨痹”、“虛勞”、“骨蝕”等范疇。“骨痹”最早見于《素問·長刺節論篇》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹”。骨痹由機體正氣不足，衛外不固，外無御邪之能，內乏抗病之力，復因久住濕地，汗出當風、冒雨、涉水，風寒濕之邪內侵于骨，遂成骨痹[9]。因此中醫以驅邪活絡、緩急止痛為原則來治療MM。

本研究發現抗骨痹方的主要4味藥的關鍵作用靶點為AKT1、PIK3CG、PTGS2等。AKT1是3個緊密相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和AKT3）之一，它被稱為AKT激酶，參與調節許多生物學過程，包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等[10]。已知AKT1是β-谷甾醇（白花蛇舌草和山慈菇）、豆甾醇（山慈菇）的作用靶點，而甾醇類化合物具有刺激網狀內皮系統增生，加強吞噬細胞吞噬癌細胞的能力[11]。譚寧華等[12]采用白花蛇舌草的乙醇提取物對腫瘤細胞株進行了細胞毒活性篩選，發現白花蛇舌草提取物有一定的細胞毒性，并從中分離出了甾醇類化合物。Gabay等[13]研究發現，豆甾醇具有抑制炎癥和基質降解的作用，可通過阻礙1L-1β誘導的NF-κB通路來發揮作用。PIK3CG（磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸-3-激酶）參與磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）的合成，PIP3在激活細胞生長、存活、增殖、運動和形態的信號級聯等方面起著關鍵的作用。本研究已篩選出PIK3CG是槲皮素（白花蛇舌草）的關鍵作用靶點。槲皮素的藥理研究中對多種惡性腫瘤細胞均有抑制生長的作用，包括胃癌細胞[14-15]、肝癌細胞[16]、乳腺癌細胞[17]等。PTGS2又稱前列腺素內過氧化物合酶2（COX2），負責合成重要的生物激素——前列腺素家族的介導物質。PTGS2的上調與細胞黏附增加、表型改變有關。據近些年來的流行病學研究，PTGS2在多種腫瘤中普遍存在過度表達的現象。已知PTGS2為對羥基芐基酮（半枝蓮）及2-甲氧基-3-甲基蒽-9，10-酮（為白花蛇舌草蒽醌類成分）的作用靶點。目前，關于蒽醌類和芳香酮類化合物抗腫瘤的研究很少，有待進一步的研究。研究者從KEGG通路富集結果中選出3個Term來進行分析，包括細胞凋亡（Apoptosis）、神經營養因子信號通路（Neurotrophin signaling pathway）、慢性粒細胞白血病（Chronic myeloid leukemia）。從STRING數據庫的Analysis可得知，白花蛇舌草和山慈菇均存在與這3個Term相關的蛋白靶點，蚤休和半枝蓮雖對上述通路無調節作用，但可調節卵巢類固醇激素分泌、花生四烯酸代謝等其它生物過程。細胞凋亡作為可以誘導腫瘤細胞凋亡的一種重要自穩機制[18-20]，一直以來是人們的研究熱點。Jiang等[21]研究了白花蛇舌草對人骨髓增生異常綜合征細胞系的凋亡誘導作用，發現其可通過激活半胱天冬酶和抑制PI3K/AKT途徑來發揮誘導細胞凋亡的作用。神經營養因子包括神經生長因子家族、膠質源性神經生長因子以及其它神經營養因子[22]。目前，關于腦源性神經生長因子（BDNF）對MM疾病機制研究較多[23]。實驗證明，BDNF、生長因子以及高親和力受體原肌球蛋白受體激酶B（TrkB）有助于MM細胞的生存[24]。血小板是BDNF等生長因子的重要儲存場所，已有研究證明血小板促進腫瘤轉移機制可能與腫瘤細胞聚集體的形成和聚集體黏附到血管內皮細胞有關[25]。郭一萌[26]觀察了槲皮素等對血小板聚集的作用，結果發現槲皮素對血小板的抑制作用最強，抑制率可達（68.33±2.43）%。慢性粒細胞白血病是一種由多能干細胞轉化而來，以骨髓粒細胞系統無限制性增生及部分分化為特征的白血病。已有研究證明，槲皮素能誘導人慢性髓系白血病細胞增殖抑制和凋亡，其機制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號傳導通路實現的[27]，而JAK2/STAT3信號傳導通路是MM細胞的重要通路，其活化受到抑制，可強烈誘導MM細胞的凋亡[28]。

本研究采用了多個網絡藥理學研究分析平臺，研究了抗骨痹方主要4味中藥的活性成分和靶點，并構建了成分-靶點網絡，蛋白-蛋白相互作用網絡，同時通過多種方法對關鍵的蛋白靶點和Hub基因相關通路進行了分析，進一步證實了抗骨痹方是通過AKT1、PIK3CG、PTGS2等多靶點及調控細胞凋亡和神經營養因子信號通路等過程從而發揮多靶點、多通路的抗MM的作用。

本研究為進一步了解抗骨痹方在治療MM中的作用機制和特點提供了網絡藥理學證據，為臨床上中醫藥方法治療骨髓瘤提供了重要的參考依據，也為進一步開發和深入研究該組方奠定了基礎。