頭頸鱗狀細胞癌中HSDL2的表達水平及臨床意義

王藝璇，王馨悅，林貞花，孫 潔，楊 洋，金愛花

頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是指由口腔、口咽、喉部和下咽的鱗狀上皮細胞形成的一組惡性侵襲性腫瘤[1]，其發病率占頭頸部腫瘤總發病率的95%以上[2]。由于HNSCC發病的高隱匿性、高轉移性以及缺乏有效的早期診斷標志物，患者的5年生存率僅40%～50%[3-4]。因此，探尋HNSCC的早期診斷標志物刻不容緩。人類羥基類固醇脫氫酶樣蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2, HSDL2)作為短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族中的成員之一，在乳腺癌[5]、甲狀腺乳頭樣癌[6]、卵巢癌[7]和胃癌[8]等多種惡性腫瘤中異常表達且發揮重要作用。目前，關于HSDL2在HNSCC中的表達尚未見報道。本文旨在探討HSDL2在HNSCC中的表達及臨床意義，為篩選HNSCC的早期診斷標志物和藥物治療靶點提供可能的分子生物學指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 組織芯片購自西安艾麗娜公司，包括61例HNSCC組織標本和11例癌旁正常組織標本。61例HNSCC中男性51例，女性10例；年齡<60歲者34例，≥60歲者27例；有淋巴結轉移者19例，無淋巴結轉移者42例；組織分化程度：高分化16例，中分化32例，低分化13例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期33例。

1.1.2主要試劑 HSDL2抗體購自美國Proteintech公司(15631-1-AP)，免疫組化SP兩步法試劑盒、檸檬酸緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色劑和蘇木精染料，均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1生信分析 應用UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)[9]分析HNSCC組織和正常組織中HSDL2 mRNA的表達及其與臨床病理特征的關系；應用HPA數據庫(https://www. proteinatlas.org/)[10]分析HSDL2蛋白(抗體編號HPA050453)在HNSCC組織和癌旁正常組織中的表達水平及其與患者總生存期的關系；應用STRING數據庫(https://string-db.org)[11]分析HSDL2的蛋白互作網絡及其可能參與的生物學進程。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化SP兩步法檢測HSDL2蛋白的表達水平，60 ℃烤片45 min，常規脫蠟，梯度乙醇水化，熱檸檬酸鹽緩沖液水浴30 min進行抗原修復，滴加一抗HSDL2(稀釋濃度為1 ∶200)，4 ℃孵育過夜；次日，辣根過氧化物酶標記二抗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照組。

1.3 結果判斷以細胞質內出現棕褐色顆粒為HSDL2蛋白陽性染色。(1)根據細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞所占百分比計分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項評分相乘作為最終得分：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()。其中≤4分為低表達，>4分為高表達。

1.4 統計學分析所有數據使用SPSS 25.0軟件進行分析，HSDL2表達與臨床病理特征的相關性分析，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HNSCC組織中HSDL2 mRNA的表達通過UALCAN數據庫分析520例HNSCC組織和44例正常組織中HSDL2 mRNA的表達水平，結果顯示：與正常組織相比，HSDL2 mRNA的表達水平在HNSCC中顯著降低(P<0.01，圖1A)。進一步分析HSDL2 mRNA的表達水平與臨床病理特征的關系，發現其與HNSCC臨床分期和淋巴結轉移密切相關(P<0.05)：HSDL2 mRNA在臨床分期Ⅰ～Ⅳ期HNSCC組織中的表達水平顯著低于正常組織(圖1B)；HSDL2 mRNA表達水平從淋巴結轉移的N1～N3期呈逐漸降低趨勢(P<0.05，圖1C)。本組HPV陰性HNSCC組織中，HSDL2 mRNA表達水平亦顯著低于正常組織和HPV陽性HNSCC組織(P<0.01，圖1D)，提示HSDL2與HNSCC的惡性演進密切相關。

圖1 UALCAN數據庫檢索HSDL2 mRNA的表達：A.HSDL2 mRNA在正常組織和頭頸鱗狀細胞癌組織中的表達；B.HSDL2 mRNA表達水平與臨床分期的關系；C.HSDL2 mRNA表達水平與淋巴結轉移N分期的關系；D.HSDL2 mRNA表達水平與HPV感染的關系

2.2 HNSCC組織中HSDL2蛋白的表達應用HPA數據庫分析HSDL2蛋白在HNSCC組織和正常組織中的表達，結果發現HSDL2蛋白主要定位于細胞質，少量表達于細胞核，在正常口腔組織中高表達(圖2A)，在HNSCC組織中低表達(圖2B)，提示HSDL2表達下調與HNSCC發生的高風險密切相關。免疫組化結果顯示HSDL2蛋白表達及定位與HPA數據庫檢索結果一致，即HSDL2蛋白在正常組織中高表達，且主要表達于細胞質(圖2C)，在HNSCC組織中低表達(圖2D)。61例HNSCC組織中，HSDL2蛋白的陽性率(57.4%，35/61)和強陽性率(34.4%，21/61)均顯著低于癌旁正常組織(陽性率90.9%，強陽性率81.8%)，且差異有顯著性(P<0.05，表1)。

ABCD

表1 正常組織和頭頸鱗狀細胞癌組織中HSDL2蛋白的表達

2.3 HNSCC組織中HSDL2蛋白表達與臨床病理特征的關系通過分析HSDL2蛋白表達與HNSCC臨床病理特征的關系發現：HSDL2蛋白低表達與HNSCC患者性別、年齡及分化程度無關，與臨床分期(P<0.01)和淋巴結轉移(P<0.05)密切相關(表2，圖3)。HSDL2蛋白在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期HNSCC組織中的強陽性率(5/33，15.2%)明顯低于Ⅰ+Ⅱ期HNSCC組織(16/28，57.1%)(P=0.001)；HSDL2蛋白在有淋巴結轉移HNSCC組織中的強陽性率(3/19，15.8%)明顯低于無淋巴結轉移HNSCC組織(18/42，42.9%)(P=0.047)；提示HSDL2蛋白可能參與HNSCC的發生、發展。

ABCD

表2 頭頸鱗狀細胞癌中HSDL2蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 HSDL2蛋白與HNSCC患者預后的關系應用HPA數據庫分析HSDL2蛋白表達與HNSCC患者預后的關系，結果發現HSDL2蛋白低表達組患者(n=393)的生存期低于高表達組患者(n=106)，差異有統計學意義(P=0.014，圖4)；提示HSDL2蛋白低表達HNSCC的患者預后不良。

圖4 HSDL2表達與HNSCC患者生存期的關系

2.5 HSDL2參與的生物學進程及蛋白互作網絡應用STRING數據庫分析HSDL2參與的生物學進程及蛋白互作網絡。GO富集分析結果顯示，HSDL2主要參與調控脂肪酸分解代謝、脂肪酸氧化、靶向調控過氧化物酶體、蛋白質的轉運等生物學進程(圖5A)。蛋白網絡分析的結果顯示，與HSDL2互作的蛋白主要包括ACSF2、ALDH3A2等(圖5B，表3)。

圖5 STRING數據庫分析HSDL2可能參與的生物學進程及互作蛋白：A.HSDL2可能參與的生物學進程(GO富集分析)；B.HSDL2互作蛋白網絡圖

表3 HSDL2 互作蛋白參與的生物學進程

3 討論

HNSCC具有病情進展隱匿、早期臨床癥狀不典型的特點，多數患者診斷時已發生淋巴結轉移，致使HNSCC的發病率和病死率在全球范圍內逐年升高[12-13]。由于HNSCC復雜的異質性，其機制尚未完全闡明；因此亟需進一步探索HNSCC中的分子標志物明確其可能的分子機制。

HSDL2最初鑒別于人胎腦組織的cDNA文庫中，定位于染色體9q32位點，編碼HSDL2蛋白[14]。該蛋白由418個氨基酸組成，包含N-端SDR結構域，C-端SCP-2結構域和過氧化物酶體靶向信號ARL[15]，對糖、類固醇和脂肪酸的能量代謝具有重要作用[16]。HSDL2作為類固醇脫氫酶家族成員之一，不僅與過氧化物酶體結合，而且還能夠與輔酶NADPH相互作用形成復合體[15]，進而調控膽固醇代謝[17-18]。近年研究顯示，HSDL2作為脂代謝中有效的調節因子在多種腫瘤中異常表達。Ruokun等[19]研究發現，HSDL2在人腦膠質瘤組織中異常高表達，且可正向調控膠質瘤細胞的增殖、周期阻滯和凋亡。Shi等[20]研究亦證實，下調HSDL2表達不僅可體外抑制肺腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，還可降低體內荷瘤的形成率及轉移率。然而，HSDL2在HNSCC發生、發展中的作用尚未見報道。

本組通過UALCAN數據庫分析發現，HSDL2 mRNA表達在HNSCC中顯著降低，其低表達與臨床分期、淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。HPV作為HNSCC的預后標志物之一，可預示患者的轉歸。HPV陽性HNSCC患者具有更長的總生存期和無瘤生存期，且與治療模式無關[21]。本組通過數據庫分析亦發現，HSDL2在HPV陰性HNSCC組織中的表達水平低于正常組織和HPV陽性HNSCC組織(P<0.01)，因此HSDL2低表達提示HNSCC不良預后可能與HPV感染有關，但仍需深入分析。免疫組化染色結果顯示，HSDL2蛋白在HNSCC組織中的表達顯著低于正常癌旁組織(P<0.05)。該結果與HPA數據庫一致，HSDL2蛋白在正常組織中呈中～高表達，在HNSCC組織中呈低表達。進一步分析發現，HSDL2蛋白表達與HNSCC臨床分期(P=0.001)、淋巴結轉移(P=0.047)呈負相關；提示HSDL2可能是作為抑癌基因在HNSCC的惡性演進中發揮作用，與Zhang等[22]在膽管癌中的研究結果相符。進一步通過HPA數據庫對HSDL2蛋白表達與HNSCC患者預后的相關性進行分析，發現HSDL2蛋白低表達患者的生存期更低，提示HSDL2蛋白低表達可能是判斷HNSCC不良預后的潛在分子標志物。

此外，通過STRING數據庫分析發現，HSDL2參與調控蛋白轉運和脂質代謝過程。這可能與HSDL2的特異性結構域有關。研究發現，HSDL2可通過C-端結構域中包含的PTS1特異性靶向過氧化物酶體，參與脂肪酸的過氧化物酶體的氧化過程[17]。同時，蛋白互作網絡分析結果顯示，HSDL2可與過氧化物酶體活化相關蛋白ECH1[23]、調節脂肪酸β-氧化過程的ALDH3A2[24]相互作用。上述結果說明，HSDL2調控蛋白轉運和脂質代謝可能涉及多種生物學途徑，其具體分子機制有待進一步分析。

近年多項研究證實HSDL2在腫瘤中扮演的角色具有“雙重性”[5-8,22]，但HSDL2的所有研究僅局限在細胞表型和分子標志物，具體調控機制尚未見報道。因此，推測HSDL2的“雙重性”可能與以下幾個方面有關：(1)HSDL2在不同腫瘤細胞中的定位不同，導致其參與的生物學過程以及信號通路不同；(2)不同腫瘤的組織特異性也可導致HSDL2的差異表達；(3)不同腫瘤細胞的微環境也可導致HSDL2的基因雙重性；(4)相關的致癌/抑癌基因也可影響HSDL2的生物學作用。總之，HSDL2的“雙重性”取決于腫瘤細胞類型、微環境、相關基因等因素，是HSDL2未來研究的重點。

綜上所述，HSDL2在HNSCC中的表達有不同程度的下調或缺失，其低表達提示腫瘤有較強的惡性程度和轉移潛能，對HNSCC的早期診斷和預后評估具有一定的指導意義。