1，2-二羥基蒽醌降低金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合生物膜的作用研究

張永臣， 虞 玲， 黃 菁， 陳 飛

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和白念珠菌（Candida albicans）都是人體黏膜上常見的定植菌，可以分別引起一系列臨床疾病，如敗血癥、尿路感染以及糖尿病足等[1-2]。然而，在臨床環(huán)境中，細(xì)菌往往不單獨(dú)存在，可以1種或者數(shù)種細(xì)菌形成混合感染，從而給臨床抗感染治療帶來更大的挑戰(zhàn)。金黃色葡萄球菌可以以白念珠菌的菌絲作為支架使二者在導(dǎo)管以及醫(yī)療器械表面形成混合生物膜。由于二者逐漸對(duì)臨床上常用的抗菌藥物耐藥，因此迫切需要發(fā)現(xiàn)一些對(duì)細(xì)菌有抑制作用的化合物來解決臨床上面臨無(wú)藥可用的局面[3]。1，2-二羥基蒽醌是一種源自茜草屬根的天然化合物，毒性小，有研究表明其對(duì)白念珠菌的生物膜形成有一定的影響，而對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合生物膜的影響仍未知[4]。本研究旨在通過探究1，2-二羥基蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合生物膜的影響及作用機(jī)制，進(jìn)而為治療由二者引發(fā)的混合感染奠定一定的基礎(chǔ)，為臨床治療金黃色葡萄球菌和白念珠菌感染提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 選取2018年某醫(yī)院臨床分離鑒定并通過VITEK 2鑒定的2株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），命名為SA1和SA2，以及2株對(duì)甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA），命名為SA3和SA4。白念珠菌DAY185購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 儀器和試劑 本研究用儀器和試劑包括紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司），NanoDrop 2000/2000c 分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司），氯仿、異丙醇（上海生工有限公司），1%結(jié)晶紫染液（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo公司），1，2-二羥基蒽醌（上海譜振生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 1，2-二羥基蒽醌對(duì)混合菌生長(zhǎng)能力檢測(cè) 將4株金黃色葡萄球菌和白念珠菌DAY185分別接種到哥倫比亞血平板以及沙保弱平板上，于35 ℃條件下靜置過夜培養(yǎng)。分別挑取單菌落于4 mL TSB培養(yǎng)基中，并于35 ℃、200 r/min條件下過夜培養(yǎng)，吸取100 μL過夜培養(yǎng)的菌液于10 mL新鮮的LB肉湯中，于37 ℃、200 r/min條件下繼續(xù)傳代培養(yǎng)，將傳代培養(yǎng)后獲得的菌液用TSB調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋賹⑵?∶100稀釋使其濃度達(dá)到106CFU/ mL，將金黃色葡萄球菌與白念珠菌按照1（10 μL）∶1（10 μL）的比例加入到4 mL TSB繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置加入10 mg/L 1，2-二羥基蒽醌的陽(yáng)性對(duì)照組，以不加1，2-二羥基蒽醌的為正常組。每2小時(shí)用測(cè)定混合菌的吸光度值（D600）以檢測(cè)1，2-二羥基蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌的混合生長(zhǎng)影響。此外，在相同條件下同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌與白念珠菌在無(wú)1，2-二羥基蒽醌條件下單獨(dú)生長(zhǎng)時(shí)以及1，2-二羥基蒽醌作用下金黃色葡萄球菌與白念珠菌生長(zhǎng)能力的變化。

1.2.2 1，2-二羥基蒽醌對(duì)單菌種以及混合菌生物膜影響測(cè)定 使用半定量結(jié)晶紫染色法檢測(cè)金黃色葡萄球菌和白念珠菌單獨(dú)生長(zhǎng)以及混合生長(zhǎng)時(shí)生物膜形成的能力[5]。細(xì)菌的培養(yǎng)如前所述，將傳代培養(yǎng)后的菌液用TSB調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋賹⑵?∶100稀釋使其濃度達(dá)到106CFU/ mL，分別吸取10 μL金黃色葡萄球菌和白念珠菌DAY185稀釋后菌液加入到含有180 μL TSB的96孔板孔中，將96孔板置于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，并以加入10 mg/L 1， 2-二羥基蒽醌為陽(yáng)性對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后，棄菌液，使用無(wú)菌PBS沖洗3次，風(fēng)干。用200 μL的100%甲醇將生物膜固定15 min。用PBS輕輕洗滌生物膜2次后風(fēng)干，并用200 μL 1%結(jié)晶紫染色10 min。用PBS沖洗染色的生物膜（3次）以除去多余的污漬并干燥。然后加入100%乙醇100 μL。每孔分別吸取100 μL 測(cè)定D595值，計(jì)算3個(gè)復(fù)孔的平均值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以及圖片繪制，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1，2-二羥基蒽醌處理后混合菌生長(zhǎng)能力分析

當(dāng)未使用1，2-二羥基蒽醌處理時(shí)，金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合菌群生長(zhǎng)良好而穩(wěn)定。在加入1，2-二羥基蒽醌的條件下，金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合菌群生長(zhǎng)受到抑制，光密度D595值下降1.5左右。MRSA和MSSA下降的趨勢(shì)類似，與白念珠菌DAY185形成的生長(zhǎng)曲線略有差異。此外，還研究了1，2-二羥基蒽醌對(duì)單種菌生長(zhǎng)能力的影響，結(jié)果顯示，其對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)能力影響較小，而對(duì)白念珠菌DAY185的生長(zhǎng)能力影響較大，可以明顯降低其生長(zhǎng)能力。見圖1。

圖 1 1，2-二羥基蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌生長(zhǎng)曲線的影響Figure 1 Effect of 1，2-dihydroxyanthraquinone on the growth of Staphylococcus aureus and Candida albicans

2.2 1，2-二羥基蒽醌作用后混合生物膜形成能力

靜態(tài)生物膜形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)未使用1，2-二羥基蒽醌處理時(shí)，金黃色葡萄球菌與白念珠菌形成混合生物膜的能力強(qiáng)，D595值在4左右（圖2A）。培養(yǎng)基中加入1，2-二羥基蒽醌10 mg/ L時(shí)，二者形成混合生物膜的能力明顯下降，D595值下降幅度達(dá)到2.0～2.5。其中，對(duì)于SA4與白念珠菌DAY185形成的混合生物膜與未處理組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SA1、SA2、SA3與白念珠菌DAY185形成的混合生物膜與未加入1，2-二羥基蒽醌相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步研究1，2-二羥基蒽醌對(duì)單菌種生物膜的影響，結(jié)果顯示1，2-二羥基蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)白念珠菌的影響差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果如圖2B所示。

圖 2 1，2-二羥基蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌和白念珠菌混生物膜形成能力的影響Figure 2 Effect of 1，2-dihydroxyanthraquinone on the formation of polymicrobial biofilms by Staphylococcus aureus and Candida albicans

3 討論

金黃色葡萄球菌和白念珠菌是臨床上重要的致病菌，兩者可以分別形成單菌種生物膜[6]。之前的研究主要聚焦于單菌種生物膜，而對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌相互作用形成混合生物膜的研究甚少。研究的結(jié)果顯示，與浮游狀態(tài)下的細(xì)菌相比，生物膜狀態(tài)下細(xì)菌的耐藥性可以增加上千倍[7]。更令人擔(dān)憂的是，相比單一菌生物膜，混合生物膜具有更強(qiáng)的致病性及抵御抗菌藥物的能力。金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合生物膜最初是在醫(yī)療器械及導(dǎo)管上形成的，隨后才播散入血造成感染并重新在黏膜組織上定植形成抗菌藥物難以清除的生物膜，因此有不少學(xué)者都提出可采用抗菌藥物處理醫(yī)療器械及導(dǎo)管，從根源上避免感染發(fā)生。但是，抗菌藥物往往有不良反應(yīng)，因此人們逐漸將目光轉(zhuǎn)移到可以降低生物膜的其他物質(zhì) 上[8]。

蒽醌通常存在于茯苓等高等植物中，還有數(shù)種天然和合成的蒽醌類衍生物已顯示具有抗微生物和抗炎活性[9-10]。1，2-二羥基蒽醌是蒽醌類的一種化合物，有研究表明其對(duì)白念珠菌有一定的抗菌作用，而對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合生物膜的抑制影響仍未知。本研究顯示1，2-二羥基蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合菌群的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其抑制作用可殺死部分金黃色葡萄球菌以及大多數(shù)白念珠菌，進(jìn)一步研究顯示1，2-二羥基蒽醌可以顯著降低金黃色葡萄球菌和白念珠菌混合生物膜形成。推測(cè)其降低混合生物膜的能力主要是降低了白念珠菌生物膜的形成，使金黃色葡萄球菌失去了支架結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使混合生物膜的形成明顯減少[11]。因此可進(jìn)一步探索與白念珠菌生物膜形成相關(guān)的基因的表達(dá)情 況。

本研究進(jìn)一步探究了1，2-二羥基蒽醌是否對(duì)白念珠菌生物膜形成相關(guān)的黏附基因的表達(dá)有影響。結(jié)果顯示：在1，2-二羥基蒽醌作用后，與白念珠菌菌絲形成相關(guān)的基因ALS3和RBT1明顯下調(diào)，說明了1，2-二羥基蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合生物膜的作用主要影響了白念珠菌菌絲的形成，導(dǎo)致混合生物膜的支架結(jié)構(gòu)受損，最終導(dǎo)致了混合生物膜總量的下降。

本研究證實(shí)1，2-二羥基蒽醌具有一定的抑制金黃色葡萄球菌與白念珠菌混合生物膜形成的能力，將為臨床上治療由金黃色葡萄球菌與白念珠菌形成的混合感染奠定一定的基礎(chǔ)。