淺談標準物質/標準樣品生產者實驗室管理

陸莉峻 方 誠 王 剛 鄭 琦

國藥集團化學試劑有限公司（上海 200002）

中國加入WTO 之后，在國外檢驗檢測企業的沖擊之下，國內檢測行業面臨著巨大挑戰，需要不斷提升檢測能力和質量管理體系水平。自從2000年原中國實驗室國家認可委員會（CNAL）簽署國際實驗室認可合作組織（ILAC）多邊互認協議之后，國內檢測機構及實驗室不斷申請通過實驗室能力認可，提升實驗室檢測能力，完善質量管理體系。同時，國家也不斷地對認可文件進行完善。2006年，成立中國國家合格評定委員會（CNAS）代替CNAL 繼續保持我國認可機構在ILAC 中實驗室認可多邊互認協議方中的地位。

根據CNAS 官方數據統計，截止到2020年9 月30 日，已獲CNAS 認可的檢驗檢測實驗室11 089家，涉及檢測、校準、醫學、生物安全、標準物質生產者、能力驗證提供者、實驗動物機構、科研等領域。但是，通過標準物質/標準樣品（RM）生產者能力認可的只有21家。由此可見，RM 生產者能力認可的數量遠遠滿足不了現在國內行業的需求。

1 RM 生產者能力認可的基礎

RM 生產者的基礎是實驗室必須具備一定的檢驗檢測能力，其評價準則是CNAS-CL01:2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》[1]，對實驗室檢測涉及的“人、機、料、法、環”5 個方面進行規定[2]，條款細化到檢測工作的各個方面，包括工作流程、崗位職責、技術要求等。根據該準則建立的實驗室管理體系，具有文件化、具體化、規范化、模式化等特點，配合內審、管理評審、外審等監管措施，可將檢測工作中的風險因素降至最低。通過CNAS-CL01 能力認可的實驗室，其檢測技術能力和檢測相關的質量管理體系，已經可以基本滿足RM 生產者實驗室管理的基礎要求[3]。在CNAS-CL04:2017《標準物質/標準樣品生產者能力認可準則》[4]中，實驗室檢測部分的條款大部分以CNAS-CL01 為準，除此之外，還規定了原材料、包裝、均勻性和穩定性、定值、數據分析等幾個關鍵環節的要求。

2 RM 生產者實驗室管理的關鍵環節

2.1 原材料

由于RM 的原材料直接影響其特性值，所以要求對原材料制定相應的管理程序，以保證后期特性值的準確和穩定。首先，對原材料的供應商選擇進行管理。對原材料供應商的質量水平和生產工藝進行調研，確定其管理體系和技術水平是否符合RM 生產需要，并且能夠保證長期穩定地提供一定數量的原料。對合格的供應商進行匯總，制定合格供應商名錄以及供應商考評機制，定期對合格供應商進行評價[5]。

其次，制定原材料驗收標準。驗收標準需要綜合考慮標準物質的性質、純度、可能存在的雜質以及特性值的應用范圍。驗收標準中，純度通常是最主要的驗收指標。純度限度范圍往往依賴于預期或者官方用途：化學對照品含量測定用原料質量分數一般要求不低于99.5%；限度檢查用原料質量分數一般要求不低于98%；非定量用原料，依具體品種情況確定。在少數情況下，可能出現原材料質量達不到預期要求，同時又沒有其他合格供應商的情況，這時就需要對原料進行一定的處理，比如，使用兩種或以上質量穩定的原料進行合成，采用物理、化學方法進行提純或者去除目標雜質，在生物領域中還會用到培育等技術。在國際標準物質的研制中，如果出現樣品質量不符要求而生產單位無精制能力，則由設在瑞典的國際化學品對照中心承擔精制[6]。

對于已經驗收完畢的合格原材料，必須有相應的監控措施，確保其在保存期間的質量不發生較大變化。對于保存時間較長的原材料，在配置RM 前需要再次進行檢測，確保其純度和特性指標符合要求。原材料在入庫之前需要進行登記，貼上唯一性標識，確保每一批原材料信息的可追溯性。原材料在交接過程中必須有相應的交接記錄，交接記錄中不僅要有原材料的溯源信息，還應包括交接的環境條件，以便后期研究外部環境條件是否會對標準物質后期特性值帶來不良影響。

2.2 包裝

RM 包裝是一個重要環節，包裝后的成品需要保證其穩定性及特性值不被影響。在包裝環節，包裝容器的選擇、包裝過程中的操作、成品標簽等需要通過制定相應的規范文件來控制[7]。不同的標準物質對于包裝的要求也不同：固體標準物質主要使用西林瓶、螺口瓶和安瓿瓶，傳統包裝方法一般采用天平稱量，在十萬級凈化環境條件下分裝，對于易吸潮、易氧化的標準物質，分裝時填充氮氣或其他惰性氣體。目前，在固體標準物質分裝中已經開始使用自動化儀器——小型螺桿式無菌粉末分裝機[8]。液體標準物質主要使用螺口瓶和安瓿瓶，一般工作試劑（標準滴定溶液、雜質標準溶液等）由于量比較大，所以使用螺口瓶；而一些純品物質（對照品標準物質、高純度液體標準物質）由于生產成本比較高，所以包裝量都比較小，一般會用安瓿瓶，在包裝過程中充入惰性氣體后熔封。目前，液體標準物質的包裝也有自動化儀器——液體蠕動泵（連續分裝）和聯動熔封機[9]。氣體標準物質需要存儲在耐高壓的氣瓶中，包裝容器的材質通常為金屬（一般為鋁合金或鐵瓶）[10]。由于化學性質的原因，某些氣體會吸附在氣瓶內壁上。在罐裝時，如果是高含量的氣體標準物質，氣瓶內壁的吸附對于含量的影響幾乎可以忽略，但是低含量的氣體標準物質，罐裝時需要進行預飽和處理。生物標準物質的分裝必須在低濕度條件下進行，包裝容器通常采用高壓聚乙烯瓶，必要時還會外套高強度復合塑料膜真空包裝，防止光照和空氣的滲入。包裝工藝也相對復雜，需要先進行冷凍干燥處理，一些特殊的標準物質還需要在真空下處理[11]。所有標準物質的標簽必須保證信息完整、內容清晰，標簽材質耐低溫、耐高溫、耐腐蝕性有機溶劑，防水性好，不易變形脫落。標簽打印應按需定量，記錄發放數量及領取時間，以便日后追溯；及時銷毀作廢的標簽及剩余標簽，避免混亂而導致貼錯標簽。

2.3 均勻性和穩定性評估

RM 的均勻性評估是為了檢驗RM 在最終包裝之后，其特性值是否均在規定的不確定度范圍內，以此來保證RM 的特性值是均勻的。不論制備過程中是否經過均勻性初檢，凡成批制備并分裝成小包單元的標準物質必須進行均勻性檢驗。對于分級分裝的標準物質，凡由大包裝分裝成小包裝單元時，都需要進行均勻性檢驗[12]。在做RM 均勻性實驗時，對于最小取樣量的確定至關重要。根據特性值的檢測方法以及購買RM 用戶的使用需求，綜合確定最小取樣量。對于通過均勻性評定的RM，取樣量越小，說明RM 的特性值越均勻。取樣的單元數取決于批的大小，隨機抽取的最小瓶數在10～30 之間，而且一般不低于10 瓶。均勻性檢驗的數據還應量化，需要滿足一定的重復性要求，以減小對標準值不確定度的貢獻。如果RM 有多個特性值，則需要對每一個特性值分別進行均勻性評估。

RM 的穩定性評估主要分為兩方面：RM 在規定的貯存條件下目標特性的穩定性，RM 在規定的運輸條件下目標特性的穩定性。通過改變對RM 可能產生影響的環境貯存條件，如光照、溫度、濕度等[13]，研究RM 會不會發生物理、化學、生物反應，同時通過分析RM 的特性值找出變化規律[14]。貯存條件的確定，需要通過長期的穩定性實驗來評估。一般來說，長期穩定性實驗的影響條件主要是貯存溫度，所以，在設置溫度點時，每個溫度點下至少10～12 瓶，時間跨度可以持續1～2年，時間點一般為5～6 個。市場上RM 的有效期一般為1年。運輸條件則需要考慮在運輸過程中溫度的變化對于RM 的影響，所以這一溫度變化范圍要比貯存的溫度變化范圍大。在運輸條件的穩定性實驗中，時間跨度一般為1～2個月，時間點的設置也是5～6 個，每個溫度點下需要6～10 瓶。在確定運輸條件后，需要擬定包裝說明，編制客戶運輸作業指導書，以降低風險因素。研究運輸條件影響時還可以使用加速穩定性實驗，即通過研究RM 在極端溫度下其目標特性值的變化情況來推測運輸條件的臨界值。

2.4 定值

RM 的定值首先需要確定其特性，是定量還是定性；如果是定量特性，那對特性的定值需要證明溯源性，即標準物質的量值能通過連續的比較鏈以給定的不確定度與國家或國際基準聯系起來。對于實驗結果的溯源性，在CNAS-CL01 中已有相關要求，主要是要求所有涉及檢測結果計算的測量儀器都需要由具有資質的檢測校準機構進行校準，并且需要提供校準結果及其不確定度。定值不確定度評定需要考慮定值過程中的影響、單元間的實際差異，以及定值隨時間和運輸貯存過程變化的影響。

2.5 數據分析

RM 的數據分析，主要分為5 個階段。

第一階段：篩查岐離值。在每一次評估數據測定完畢后，需要去除岐離值，采用Grubbs 法或Dixon法[15]。

第二階段：對數據進行正態分布檢驗。正態分布檢驗中最直觀的是圖檢驗，如頻率直方圖、QQ 圖等；但是圖檢驗之后，一般還需要結合規范性檢驗方法，常見的有偏鋒檢驗法、夏皮羅·威爾克（Shapiro·Wilk）法（W 檢驗法）、達戈斯提諾（D’Agostoon）法（D檢驗法）、愛潑斯·普利（Epps·Pulley）法等[16]。W 檢驗法適用于數據量在100 以內的情況[17]，D 檢驗法適用于數據量為50～1 000[18]的情況，愛潑斯·普利法則適用于數據量大于8 的情況[19]。

第三階段：均勻性評估。均勻性評估需要分別評估單元間均勻性和單元內均勻性。常用的檢驗方式有ANOVA 方式和替代方式[20]。ANOVA 方式就是方差分析方式，又稱“變異系數分析”或者F 檢驗法，用于兩個及兩個以上樣本均數差別的顯著性檢驗。計算時通過方差分析得出F 檢驗值，將其與所選擇的置信概率下的臨界值進行比較，最終得到均勻性評估結論。替代方式雖然可以減少測量次數，但是其統計可靠性相對較低，所以現在很少被使用。

第四階段：穩定性評估數據處理。一般情況下會選擇單一保存條件下的多時間點測量數據，使用直線擬合法（即線性模型）記錄擬合曲線斜率與截距，使用t 檢驗法，判斷斜率與零是否有顯著性差異。目前有一些新的實例，在穩定性評估過程中，通過極差質控圖和均值質控圖，結合線性回歸的結果，能直觀地發現異常值，對異常值的檢測更加靈敏[21]。

第五階段：標準物質定值。為標準物質定值的方式有多種，一是單一實驗室采用單一基準方法定值，二是單一實驗室采用兩種或多種不同原理的獨立參考方法定值，三是多家實驗室使用一種或多種已證明準確性的方法合作定值，四是利用特定方法定值，五是利用一級標準物質進行比較定值。其中,基準方法具有國家最高計量學品質，能夠確保測量的有效性，在標準物質定值中具有重要地位。1998年，化學計量物質的量咨詢委員會（CCQM）第四次會議在法國巴黎召開,此次會議對基準方法進行了如下定義:基準方法是具有最高計量品質的方法，其操作可以被完全地描述和理解，其不確定度可以用國際單位表述[22]。目前，單一實驗室采用單一基準方法或者聯合多家實驗室用單一基準方法進行定值的方式較為普遍。

3 結語

標準物質的整個研制過程可以概括為原材料制備、成品包裝、分析檢測、均勻性和穩定性評估、定值。其中：分析檢測依據CNAS-CL01 的要求進行；其他各個關鍵環節均需達到CNAS-CL04 的要求，原料純度越高越好；產品包裝需要根據不同標準物質的物理化學特性，保證標準物質不會因與包裝容器發生反應而失效；均勻性和穩定性評估都是以數理統計的方法，證明標準物質在規定的使用條件下，其特性值能保持均勻、穩定，不受外界客觀條件的影響；定值則是根據制定的實驗方案及定值方式，將所得結果進行合并，給標準物質進行定值。通過分析，標準物質的研制過程就直觀很多，只要一個個環節去攻克，同時制定相應的文件進行嚴格管理，就能很好地實現標準物質生產過程細致且規范的管理，也就能達到CNAS-CL04 的要求，將實驗室的管理及技術能力提升一個層次。

中國與國際合作交流日益加強，對國內實驗室的要求也不斷提高。對于實驗室的發展來說，CNAS-CL01 是基礎，CNAS-CL04 是目標，通過標準物質的研制生產，賦予產品技術高附加值，才能真正做到技術發展。近年來，各行各業對標準物質品種和數量的需求不斷增加，這對國內標準物質的研制生產是一個重大機遇。一旦真正掌握一種標準物質的研制生產，開發其他同類型的標準物質就會相對輕松，至少在生產管理方面沒有太多問題，這也是企業發展核心競爭力、打造高質量發展的重要途徑之一。