二代測序檢測非小細胞肺癌多驅動基因突變對臨床診療的意義

鄭文亮，郗彥鳳，高 寧，郭江紅，白 瑋，郭艷琳

肺癌是全球最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要類型，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的75%～85%。NSCLC患者一般在確診時已是晚期，預后較差。近年來，NSCLC的治療在驅動基因抑制劑、效應通路抑制劑和免疫抑制劑的研發等方面取得發展。在治療前全面了解NSCLC驅動基因突變譜，能夠幫助臨床選擇合適的靶向藥物進行治療，從而有效延長患者的生存期。目前臨床病理常用的檢測技術尚存一定的局限性，無法同時進行多基因、多位點的定性定量檢測。本實驗通過二代測序技術(next-generation sequencing, NGS)對209例NSCLC進行10種驅動基因突變聯合檢測，分析這些驅動基因突變特點及其與臨床病理特征的關系；對NGS檢測與FISH、免疫組化(IHC)、RT-PCR檢測結果進行一致性分析，探討應用NGS技術對NSCLC驅動基因聯合檢測的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年3月～2018年3月山西省腫瘤醫院手術切除且經病理確診的209例中晚期NSCLC石蠟包埋組織。其中，男性128例，女性81例；年齡范圍31～82歲，中位年齡59歲，分為兩組：≥60歲104例，<60歲105例；有吸煙史110例，無吸煙史99例；臨床分期：Ⅲ期87例，Ⅳ期122例；腺癌178例，非腺癌(包括肺大細胞癌、肺鱗癌、肺神經內分泌癌及肺腺鱗癌)31例。收集入組病例往期院內EGFR-PCR檢測結果，ALK融合FISH和IHC檢測結果，ROS1-PCR檢測結果。

1.2 DNA提取與突變檢測209例肺癌組織樣本按照廈門艾德的核酸提取試劑(FFPE DNA/RNA閩廈械備20150082號)提取DNA用于Illumina MiniSeq測序平臺(Illumina NextSeqCN500貝瑞合康)進行測序，根據廈門艾德人類癌癥多基因突變聯合檢測試劑盒說明書進行基因突變檢測。

1.3 統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，變量組間比較采用χ2檢驗，理論頻數<5的則采用Fisher確切概率法，不同檢測方法之間的一致性分析采用Kappa檢驗。

2 結果

2.1 10種驅動基因聯合檢測突變情況209例NSCLC中10種驅動基因突變聯合檢測總體突變陽性率為69.9%(146/209)，分別是EGFR(37.6%，80/209)、ALK(13.1%，28/209)、KRAS(11.3%，24/209)、ROS1(3.3%，7/209)、HER-2(1.9%，4/209)、PIK3CA(1.4%，3/209)、BRAF(0.9%，2/209)、RET(0.5%，1/209)、MET(0，0/209)、NRAS(0，0/209)。有3例為兩種基因共存突變(表1)。

表1 3例多基因共存突變病例

2.1.1EGFR基因突變情況 在EGFR基因單一突變的78例患者中單位點突變74例，Exon19占48.7%，Exon21占43.6%，Exon20占2.6%；4例雙位點突變(5.1%)。主要包括Exon19del、Exon19delins；Exon20ins、T790M、S786I；Exon21 L858R、L861Q(表2)。

表2 EGFR突變位點情況

2.1.2ALK基因融合突變情況 27例ALK基因融合突變，包括EML4 Exon13-ALK Exon20(51.8%)，EML4 Exon6-ALK Exon20(33.3%)，EML4 Exon18-ALK Exon20(7.4%)，EML4 Exon20-ALK Exon20(3.7%)，EML4 Exon13-ALK Exon20(3.7%)。

2.1.3KRAS基因突變情況 24例KRAS基因突變中Exon2突變占95.8%(23/24)，包括G12C(33.3%)，G12V(33.3%)，G12A(20.8%)、G12D(4.2%)、G12S(4.2%)；Exon3-Q61H突變1例(4.2%)。

2.1.4其他基因突變情況 7例ROS1融合突變，包括6例CD74-ROS1、1例GOPC-ROS1。HER-2突變4例，均為p.A775_G776insYVMA突變。PIK3CA基因H1047R突變2例。BRAF V600E突變2例。RET融合(KIF5B-RET融合)1例。未檢出MET和NRAS突變陽性病例。

2.2 NGS檢測結果與臨床標準方法檢測結果一致性分析

2.2.1EGFR基因突變檢測結果一致性分析 209例NSCLC樣本NGS檢測結果顯示EGFR陽性突變80例(包含2例雙基因突變)，陽性率為38.3%，分別為19del 40例，L858R 36例，T790M 3例，20ins 2例，L861Q 2例，S768I 1例。RT-PCR檢測結果顯示EGFR陽性突變72例，陽性率為34.4%，分別為19del 38例，L858R 34例，T790M 2例，L861Q 2例，S768I 1例。一致性分析結果顯示具有極強一致性(Kappa=0.897，P<0.000 1，表3)。NGS檢測與院內RT-PCR檢測EGFR基因突變位點19del、L858R和其他幾種稀有突變一致性分析，均具有極強的一致性(Kappa值分別為0.905、0.897、0.829)。

表3 EGFR基因NGS檢測與PCR檢測結果一致性分析

2.2.2ALK融合檢測結果一致性分析 209例NSCLC中205例有ALK院內FISH檢查結果，NGS結果與FISH檢測結果一致性分析顯示，兩者具有極強一致性(Kappa=0.898，P<0.000 1)。NGS結果與IHC檢查結果一致性分析，兩者具有極強一致性(Kappa=0.920，P<0.000 1，表4)。

表4 ALK融合NGS檢測與FISH、IHC檢測結果的一致性分析

2.2.3ROS1檢測結果一致性分析 將本次對ROS1融合基因的NGS檢測結果與院內PCR結果進行一致性分析結果顯示，兩者具有極強一致性(Kappa=0.931，P<0.000 1，表5)。

表5 ROS1融合突變NGS檢測與PCR檢測結果一致性分析

2.3 各驅動基因突變情況與NSCLC臨床病理特征的關系EGFR突變與患者性別、是否吸煙、TNM分期、組織學類型具有相關性，與患者年齡、腫瘤的發生部位無關。ALK基因融合與患者性別、是否吸煙具有相關性。KRAS基金突變與患者性別、年齡具有相關性。ROS1基因融合與TNM分期具有相關性(表6)。

表6 各基因突變與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

3 討論

我國NSCLC驅動基因EGFR突變陽性率最高，其次是KRAS和ALK，ROS1和BRAF突變陽性率相對較低[1]，本組NSCLC驅動基因檢測EGFR突變陽性率為37.6%，KRAS陽性率為11.3%，ALK為13.1%，ROS1為3.3%，BRAF為0.9%，與該研究結果基本一致。EGFR突變在Exon19高發，其次是Exon21，Exon20相對較少[2]。在本組EGFR陽性病例中，Exon19突變占48.7%，Exon21占43.6%，Exon20占2.6%，與之前的研究結果一致。KRAS突變絕大多數發生在Exon2，Exon3陽性率較低[2]。KRAS基因突變類型中G12C和G12V最為常見[3]。本組中KRAS陽性Exon2突變占95.8%，主要突變類型是G12C和G12V(66.6%)，與之前的報道基本一致。ALK-EML4是ALK融合的主要類型，并且均為腺癌患者[4]，本組27例均為ALK-EML4融合，在腺癌中的比率為92.6%。本組結果與文獻報道基本吻合，不同研究可能會因為檢測方法和檢測樣本的不同導致檢測結果存在一定的差異。

EGFR突變好發于具有以下特征人群：亞洲人、女性、非吸煙者、腺癌[5]，本組EGFR突變在性別、是否吸煙及組織學類型的統計結果與文獻報道相一致。另外，Ⅳ期較Ⅲ期突變陽性率高，差異有顯著性，與黃清潔等[6]報道一致。ALK重排在女性患者、非吸煙人群及腺癌中多見[7]。本組中ALK陽性在患者性別和是否吸煙組差異具有顯著性，與該報道一致。我國男性NSCLC患者KRAS基因突變陽性率高于女性，并且在腺癌中多見[8]，在本組中KRAS突變多為60歲以上男性患者。KRAS突變與吸煙的關系存在爭議，在本組中KRAS突變陽性吸煙者明顯高于非吸煙者。

在NSCLC中，極少數患者有2個或3個基因突變共存，其中EGFR/KRAS最常見，其次是ALK/KRAS[1]。EGFR與ALK在NSCLC中也有共存現象，盡管這種共存突變的幾率相對較小[9]，其他研究中也有報道EGFR和ALK聯合突變的病例[10]。本組中發現共存突變EGFR/ROS1、EGFR/PIK3CA、ALK/BRAF各1例。MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路調節細胞生長、增殖、分化、遷移和凋亡，而EGFR、ALK、ROS1、BRAF和PIK3CA對這兩種信號通路均有調節作用[11]。這幾種基因在單獨突變激活狀態下都可能導致腫瘤的發生和發展，但是對于基因共存突變的發生機制以及共存狀態下是否彼此影響尚不清楚。另外，聯合突變是否比單一突變患者的預后更差尚不清楚。相關的臨床靶向治療研究發現，當EGFR突變合并有其他驅動基因改變時，會降低對EGFR-TKIs的敏感性[12]。說明驅動基因共存狀態下可能產生了某種“協同作用”，從而產生了靶向藥物抵抗。因此，多基因共存突變的發生機制以及在腫瘤中作用機制的研究應當引起重視。

在NSCLC靶向治療前，全面了解腫瘤突變情況才能針對腫瘤的高度異質性實施有效治療。許多新的治療方案也在開發中，比如聯合不同腫瘤的靶向藥物進行治療[13]，聯合同一突變基因各代靶向藥物進行治療[14]?；颊呋蛲蛔儽硇托枰M行準確且全面的掌握，甚至需要動態檢測。目前在臨床病理中使用的檢測技術尚有不足，FISH價格昂貴、技術要求高，IHC無法明確融合基因類型[15]；RT-PCR對于從福爾馬林固定石蠟包埋樣品組織中提取的RNA質量較差；Sanger測序法成本高、通量低。而且臨床靶向藥物的多樣化導致檢測項目增多，在實際診斷檢測過程中微量標本難以滿足多項檢測，而NGS技術只需從福爾馬林固定石蠟包埋組織樣品中提取10 ng DNA或RNA，就能有效地擴增和測序多個基因。本組對NGS與其他幾種檢測技術結果的一致性進行分析，結果證明其準確性極高。因此，NGS檢測正是目前臨床病理診斷以及靶向藥物治療優秀的輔助檢測手段，可以為臨床NSCLC驅動基因突變的診療提供可靠支持。