不同切片厚度免疫組化標記Ki-67對惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤鑒別診斷的影響

吉佳樂，曾 暉，徐 丹，張 宇，林 爽，姚馨悅，何志承

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)是臨床上最常見的淋巴系統惡性增殖性疾病，占整個淋巴瘤的90%以上，發病率和病死率位居惡性腫瘤前10位，且呈逐年增加的趨勢[1]。目前臨床上最常見的兩種NHL分別是黏膜相關淋巴組織(mucosa associated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤和彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)。Ki-67作為反應細胞增殖的重要標志物，其增殖指數(proliferation index, PI)高低可用于淋巴瘤分級鑒別診斷和預后指導，且Ki-67 PI值越高，患者預后越差[2]。在病理診斷工作中，通常采用免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)方法對Ki-67表達進行檢測，其結果判讀的準確性和穩定性至關重要。ASCO/CAP指南指出處理手術病理標本時，常規HE切片厚度應在4～5 μm，但對IHC切片厚度并沒有給出明確標準。因此，本文選取了2、4、6、8 μm 4種切片厚度，對石蠟切片厚度與IHC染色中惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤組織Ki-67表達的影響進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集陸軍軍醫大學第一附屬醫院2016年4月～2019年4月收治的淋巴瘤標本46例，其中MALT淋巴瘤18例，年齡46～78歲；DLBCL 28例，年齡27～77歲；所有患者術前均未進行任何治療。

1.2 主要試劑及儀器Ki-67、OptiView DAB IHC Detection Kit購自美國Ventana公司；BenchMark XT全自動免疫組化染色機購自美國Ventana公司。

1.3 IHC標本經固定脫水后制成蠟塊，并分別以2、4、6、8 μm厚度連續切片，60 ℃烤片備用。將制備好的切片放入BenchMark XT中，并設定相應程序進行染色：75 ℃烤片4 min；EZ Prep溶液76 ℃脫蠟4 min；Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復液99 ℃修復30 min；抑制劑孵育45 min；加入Ki-67抗體60 μL，37 ℃孵育40 min；Reaction Buffer Concentrate(10×)緩沖液清洗5 min；37 ℃下二抗孵育8 min；DAB顯色8 min，蘇木精Ⅱ襯染12 min，返藍液返藍4 min。

1.4 IHC結果判定平均陽性染色面積百分比(average positive staining area percentage, APSAP)，可反映相應病例染色結果中的陽性細胞表達情況。姜洋等[3]研究表明：APSAP法分析IHC結果與人工計數分析方法的符合程度較高，可以作為衡量圖片中陽性細胞百分數的方法。細胞核出現棕黃色顆粒為Ki-67陽性細胞，同一病例不同切片厚度隨機選取8個(200×)相同視野。用Image J軟件對每個標本檢測結果中的陽性信號進行定量分析，得到相應的APSAP，與臨床判讀的實際陽性信號比例相比，誤差約5%。

1.5 統計學分析采用SPSS 22.0軟件對Ki-67不同表達組的APSAP數據進行統計學分析。采用t檢驗和Two-way ANOVA分別對組內和組間進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

為減少統計誤差，本實驗根據Ki-67判讀結果，將MALT淋巴瘤分為低表達組(0≤Ki-67陽性率<20%)、較低表達組(20%≤Ki-67陽性率<40%)；將DLBCL分為中表達組(40%≤Ki-67陽性率<60%)、較高表達組(60%≤Ki-67陽性率<80%)、高表達組(Ki-67陽性率≥80%)。

2.1 切片厚度對染色強度的影響與2 μm厚度切片相比，4、6、8 μm厚度切片非特異性染色逐漸增多；6、8 μm厚度切片的組織結構與2、4 μm厚度切片相比出現一定程度組織脫落的現象(圖1～3)。切片厚度與MALT淋巴瘤和DLBCL中Ki-67表達呈正相關，隨著切片厚度的增加，病灶細胞核染色逐漸加深；當切片厚度在4 μm(±1 μm)時，組織結構相對完整，背景較為干凈，更利于細胞計數。

①A①B①C①D②A②B②C②D③A③B③C③D

2.2 切片厚度對APSAP的影響Ki-67低、較低、中、較高及高表達組中，各切片厚度之間比較差異有顯著性(P<0.05，表1)。比較各組中4種切片厚度的APSAP，結果提示組織切片越厚，其對應的APSAP值越高。比較5組Ki-67表達中各組間4種切片厚度對應的APSAP增長幅度和標準差可以發現：低表達組、較高及高表達組中厚度4 μm或6 μm切片APSAP對應的標準差分別低于2 μm和8 μm。綜合分析結果顯示：隨著切片厚度的增加，Ki-67的APSAP也隨之增加；組織切片厚度為4 μm或6 μm時，誤差相對較小，可得到較為穩定可靠的檢測結果。

表1 淋巴瘤組織不同切片厚度與Ki-67 APSAP的關系

3 討論

NHL具有很強的異質性，根據腫瘤細胞增殖速度和臨床特點，臨床上主要將NHL分為惰性淋巴瘤、侵襲性淋巴瘤和高度侵襲性淋巴瘤[4]。目前最常見的是MALT淋巴瘤和DLBCL，MALT淋巴瘤臨床呈惰性表現；DLBCL有高度侵襲性且生長快速，若低度惡性的MALT淋巴瘤患者不及時治療，惡化為DLBCL的機率較大[5]。活檢穿刺組織如胃、腸等標本較小且部分含有壞死或纖維化的病變成分，僅靠單一的形態學分析難以對NHL進行準確的分型分級，需結合免疫組化標記對NHL進行聯合診斷。Ki-67作為一種反映NHL細胞增殖活性的核表達蛋白，是MALT淋巴瘤和DLBCL鑒別診斷的關鍵指標，Ki-67 PI是低度惡性MALT轉化為DLBCL的一種量化指標[6-7]。Broyde等[8]研究顯示，Ki-67 PI為45%時，可作為區分惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤的臨界值，侵襲性淋巴瘤惡性程度高于惰性淋巴瘤，且在高侵襲性淋巴瘤中Ki-67表達顯著高于惰性淋巴瘤。Hashmi等[9]研究表明，Ki-67在MALT淋巴瘤中陽性細胞數一般不高于20%，在DLBCL中陽性細胞數一般不低于40%，有的呈過表達，陽性細胞數達90%以上。由于淋巴組織細胞豐富、間質少，切片過厚、染色深或有不著色的發白區等都會對病理醫師診斷造成困擾。

文獻報道，除標本類型、標本的固定及脫水、石蠟包埋、切片質量、抗原修復、一抗孵育、實驗室水質等因素外，組織切片厚度對IHC結果也存在一定影響[10-11]。由于淋巴瘤腫瘤細胞胞核較大，如果切片較薄可能使部分抗原信號丟失，導致Ki-67檢測受影響；而切片較厚則導致組織切片脫落，細胞計數過程中需不斷調節顯微鏡微距，同時也不易區分核分界，容易造成細胞計數差異，導致結果誤判。因此，需要探索出適宜的切片厚度，既能夠保持組織細胞完整性，又能染色均勻，易于計數，得到比較準確穩定的計數結果，為臨床病理診斷提供可靠依據。有研究報道組織切片間2 μm的差異對染色強度有一定程度的影響，導致IHC中標志物染色結果的錯誤判讀。本實驗對MALT淋巴瘤和DLBCL兩種病變標本切片厚度分別選取2、4、6、8 μm四個變量進行分析，結果顯示，隨著切片厚度的增加，病變部位細胞核染色逐漸加深：當切片厚度為2 μm時，暴露細胞核層數相對較少，組織抗原暴露不充分，使IHC染色較淺且顏色對比不鮮明，對于陽性細胞較少的標本不好計數，同時病灶細胞核染色較淺；隨著切片厚度的增加，暴露細胞核層數逐漸增多，個別病灶細胞可能出現重疊，所以細胞核染色逐漸加深；此外，隨著切片厚度的增加，組織橫斷面細胞數增加，細胞核染色強度為3+的細胞數相對多于細胞核染色強度為2+和1+的細胞數，故組織總體染色強度加強。但是當切片厚度為8 μm時，細胞結構較厚，會出現非特異性染色，不利于細胞計數，并伴隨有部分組織斷裂和脫片。相比之下，4 μm和6 μm厚度切片組織結構清晰完整，沒有明顯的組織斷裂和脫片，染色對比鮮明，可以很好的分辨并進行細胞計數。此外，本實驗中Ki-67的APSAP也隨著切片厚度的增加而增加，中～低表達組、中表達組、中～高表達組及高表達組中切片厚度2～8 μm的APSAP差值大于15%，導致計算出來的陽性細胞面積比例增大，使對應的陽性細胞數增多，從而也會導致Ki-67 PI出現較大差異。特別是對Ki-67增殖指數處于臨界值45%的組織而言，如果APSAP偏高，可能導致Ki-67增殖指數大于45%；APSAP偏低，可能導致Ki-67增殖指數小于45%，這兩種結果都可能誤導醫師對MALT淋巴瘤和DLBCL的鑒別診斷。所以，切片厚度過薄或過厚都會導致細胞計數誤差較大，計數結果可能誤導醫師診斷。因此對于Ki-67增殖指數為45%左右的淋巴瘤組織，建議切片厚度在4～6 μm，該范圍內的APSAP誤差較小，可獲得較為穩定可靠的結果，更為準確地輔助醫師診斷。