前列腺癌組織中Nanog、SOX2的表達及其臨床意義

李 梅，何桂芳，李明鳳，鄭露露，蔡永萍,，尹 玉,

目前，前列腺癌(prostate cancer, PCa)的發病率和病死率均較高，已成為男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤[1]。由于我國人民生活方式日趨西化及醫療水平的提高，PCa的檢出率逐年增加。因此，識別新的診斷和治療方案研究PCa的發病機制意義重大。Nanog基因是腫瘤干細胞的轉錄因子，在維持干細胞的多能分化性、調節細胞增殖及非對稱分裂起關鍵作用[2]。Nanog在多種實體腫瘤的癌變和進展中起主導作用，包括乳腺癌、胚胎性癌癥、精原細胞瘤和原位睪丸癌等；且Nanog表達增加與癌癥的臨床進程有關[3]。在PCa干細胞研究中，Gong等[4]認為Nanog作為維持干細胞多能性的關鍵分子，是分離和鑒定PCa干細胞的標志物；Jeter等[5]也提出Nanog可以促進PCa的干細胞特性，可促進去勢抵抗性PCa細胞的再生。SOX2是SOX基因家族的重要成員，最近的研究表明，SOX2與轉移性PCa的發生、發展和預后不良有關。同時SOX2與Nanog協同對維持胚胎干細胞多能性以及特定組織成體干細胞自我更新的能力具有關鍵作用。本文收集PCa組織和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)組織，檢測Nanog和SOX2的表達，探討兩者的相關性及其與PCa發生、發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2016年12月安徽醫科大學第一附屬醫院行活檢或手術切除的前列腺標本127例，其中62例BPH ，年齡56～86歲，平均69.89歲；65例PCa，年齡53～88歲，平均69.25歲。所有患者均未接受放、化療或免疫治療，均經兩名資深病理醫師采用雙盲法判讀。PCa組織按Gleason評分以主要分化程度和次要分化程度分別評分，兩項評分相加≤4分為高分化組，5～7分為中分化組，8～10分為低分化組。

1.2 試劑與方法Nanog 兔多克隆抗體(濃度1 ∶400、14295-1-AP)、SOX2 兔多克隆抗體(濃度1 ∶400，11064-1-AP)及免疫組化MaxVision 試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。石蠟包埋組織連續切片，厚4 μm，免疫組化采用MaxVision 法染色，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，用已知陽性組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷Nanog和SOX2主要表達于細胞核或細胞核/質。(1)根據細胞染色強度評分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞染色百分比評分：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結果相乘，采用半定量評分標準判斷，<6分為低表達，≥6分為高表達。

1.4 統計學分析應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗分析兩組樣本間的表達率差異，采用Spearman等級相關分析進行兩者之間的相關性檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BPH和PCa組織中Nanog的表達Nanog陽性主要定位于正常腺體的上皮細胞核和癌變細胞核或細胞核/質。Nanog在62例BPH組中有12例呈高表達，陽性率為19.4%；在65例PCa組中有26例呈高表達，陽性率為40.0%，兩組間差異有統計學意義(χ2=6.450，P<0.05，表1，圖1、2)。Nanog在21例轉移性PCa組中有17例呈高表達，陽性率為81.0%；在44例非轉移性PCa組中有9例呈高表達，陽性率為20.5%；兩組間差異有統計學意義(χ2=8.354，P<0.05，表2)。

表1 良性前列腺增生及前列腺癌組織中Nanog和 SOX2的表達

表2 非轉移性及轉移性前列腺癌組織中Nanog和 SOX2的表達

2.2 BPH和PCa組織中SOX2的表達SOX2陽性主要定位于正常腺體的上皮細胞核和癌變細胞核或細胞核/質。 SOX2在62例BPH組中有11例呈高表達，陽性率為17.7%；在65例PCa組中有24例呈高表達，陽性率為36.9%；兩組間差異有統計學意義(χ2=5.848，P<0.05，表1，圖3、4)。SOX2在21例轉移性PCa組中有14例呈高表達，陽性率為66.7%；在44例非轉移性PCa組中有10例呈高表達，陽性率為22.7%，兩組間差異有統計學意義(χ2=4.976，P<0.05，表2)。

①②③④

2.3 PCa中Nanog、SOX2表達與臨床病理特征的關系PCa組中Nanog和SOX2表達均與TNM分期、有無淋巴結和骨轉移相關(P<0.05)；與患者年齡、術前PSA值均無關(P>0.05)。與Nanog不同的是，SOX2表達高低與Gleason評分無關(P>0.05，表3)。

表3 前列腺癌中 Nanog、SOX2表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 PCa中Nanog、SOX2表達的相關性PCa組織中Nanog、SOX2同時高表達18例，同時低表達33例；提示兩者的表達呈正相關性(rs=0.297，P=0.003，表4)。

表4 前列腺癌中Nanog和SOX2表達的相關性

3 討論

PCa的早期階段行雄激素剝奪治療被認為是這一時期患者的有效治療手段。由于PCa具有高度異質性和多灶性的生物學特性，治療一段時間后多數患者開始對雄激素剝奪出現抵抗，將發展成為去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)。CRPC變異體是神經內分泌性前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer, NEPC)，具有高度侵襲性且療效較差[6-7]。目前尋找雄激素剝奪治療后的耐藥機制及這一階段有代表性的標志物已引起學者們的極大關注。最近癌癥干細胞(cancer stem cell, CSC)理論增加了對癌癥發展的理解，據文獻報道CSC在不同組織的多種實體瘤中發生[8]，且在PCa惡性程度和腫瘤內異質性形成中有重要作用[9]。腫瘤干細胞理論認為PCa組織具有不均一性，激素治療可殺死大部分癌細胞，但是這些存活下來的具有致瘤潛力的小部分癌細胞又可隨時間的推移而生長，為PCa經過激素治療后復發轉移現象提供了依據[10]。為了延長PCa患者的生存期，在預測轉移性PCa可能的致病因素或治療靶點時，本實驗收集具有干細胞特性的Nanog、SOX2蛋白作為分析對象，結果顯示在轉移性PCa組織中，Nanog、SOX2蛋白的表達遠遠高于非轉移性PCa組和BPH組。

最近研究表明，SOX2與轉移性PCa患者的病情發展和預后不良有關。在PCa早期SOX2表達較低，但隨著Gleason評分的增加而顯著增加[11]。此外，SOX2在大多數淋巴結陽性PCa組織中表達[12]，而晚期PCa中SOX2表達增加與不良生存能力密切相關[11]，與本組結果一致，SOX2在轉移性PCa組織中表達較高。Nanog在多種惡性腫瘤中具有自我更新和多能性，在前列腺腺癌細胞中也呈陽性反應[13]。在人類前列腺腺癌細胞中已觀察到Nanog、OCT4、SOX、CD44、NESTIN的表達[14]，表明CSC和祖細胞在PCa發生、發展中有重要作用。同時，Nanog和SOX2在預測PCa病程中的價值報道較少。本組檢測CSC標志物Nanog和SOX2的表達，結果表明Nanog和SOX2在PCa中的表達明顯高于BPH，且與TNM分期、淋巴結轉移、骨轉移呈正相關。

體外實驗顯示Nanog與自我更新能力和集落形成活性等惡性指標有關[15]，特別在雄激素敏感性和CRPC細胞系中，Nanog過表達促進實驗動物的移植瘤形成。文獻報道80%的PCa中存在Nanog mRNA表達[16]。同時，在惡性轉化細胞中Nanog基因的水平最高，而BPH中未檢測到，表明Nanog可能參與PCa的發生[17]。本組實驗中通過對 Nanog蛋白檢測，顯示 Nanog蛋白的陽性率在PCa組織尤其是轉移性PCa組織中明顯高于非轉移性PCa組織，提示Nanog蛋白表達可能與PCa的發生、發展相關。

SOX2是屬于SOXB1組的SOX基因家族成員。SOX2是胚胎發育的關鍵轉錄因子，通常被認為是維持胚胎干細胞的多能性和自我更新特性的關鍵調節劑[18]。有文獻報道從早期PCa的特異性基因表達下降就伴隨SOX2表達，一直持續到末期NEPC[19]，提示SOX2在驅動NEPC分化中潛在的關鍵作用。張振宇等[20]分別采用免疫組化、Western blot法及RT-PCR檢測SOX2在PCa中表達均明顯高于BPH，且與淋巴結轉移呈正相關，與本實驗結果一致。本組結果表明，SOX2在PCa中尤其是轉移性PCa中表達升高，與TNM分期、淋巴結轉移、骨轉移有關。

本組中Nanog和SOX2在PCa中的表達明顯高于BPH，隨臨床分期和病理分級增加，其陽性率逐漸增高。此外，Nanog陽性率隨Gleason評分的增加而增高，與相關報道結果一致，且兩者在PCa中的表達呈正相關；提示在PCa發生、發展過程中Nanog和SOX2可能同時被調控，兩者之間可能有協同關系影響PCa的進展。因此，作者猜想Nanog和SOX2在PCa的發生、發展中發揮重要作用，聯合檢測Nanog和SOX2有望成為診斷PCa新的分子標志物，為臨床治療提供新思路。