免疫組化雙重染色技術在胸腺腫瘤PD-L1檢測中的應用

邢 杰，趙繼開，丁聞潔，韓昱晨

PD-1/PD-L1通路已經在多種腫瘤中進行了廣泛深入的研究，如黑色素瘤、結腸癌、肺癌、乳腺癌等，并且PD-1/PD-L1表達可能與惡性腫瘤的臨床病理特征或不良預后相關[1-3]。近年來國內外關于胸腺瘤PD-1/PD-L1的研究較少，但均表明PD-L1表達與胸腺腫瘤(包括胸腺瘤和胸腺癌)的組織學類型、Masaoka分期以及療效相關，并且能夠提示腫瘤的惡性程度及預后[4-7]。常規(guī)PD-L1檢測方法為免疫組化，但PD-L1在正常的胸腺上皮細胞及淋巴細胞中也有表達[8-9]，可能使得免疫組化染色結果判讀困難，為解決這一問題，作者嘗試采用p63+PD-L1免疫組化雙重染色法對胸腺腫瘤進行染色，由于p63廣泛表達于上皮源性腫瘤細胞胞核，p63+PD-L1免疫組化雙重染色法能夠更加清楚的判斷胸腺源性上皮細胞的PD-L1陽性率。

1 材料與方法

1.1 材料收集上海市胸科醫(yī)院病理科存檔的胸腺腫瘤手術切除樣本60例，其中B1、B2及B3型胸腺瘤各15例，胸腺癌15例，每例胸腺腫瘤連續(xù)切片3張，分別用于HE染色、PD-L1免疫組化染色、p63+PD-L1免疫組化雙重染色。

1.2 染色方法標本均經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，免疫組化染色采用Multimer法，染色平臺為Dako Link 48全自動免疫組化染色平臺，一抗PD-L1(22C3，1 ∶50，Dako公司)、p63(1 ∶300，上海長島生物公司)，其他試劑均為Dako Autostainer Link48全自動免疫組化染色平臺專用試劑，購自安捷倫科技(上海)公司。

1.3 結果判斷將染色后的切片交由科內經過PD-L1判讀專業(yè)訓練的3名醫(yī)師閱片，并根據判讀的難易程度進行評分，評分內容包括染色效果、特異性著色部位及非特異性著色部位判斷，然后進行綜合評分，易于判讀為Ⅰ級，判讀難度一般為Ⅱ級，難以判讀為Ⅲ級，3名醫(yī)師分別就相應的切片進行分級，每個級別取3名醫(yī)師打分的平均值。將判讀結果進行統計學分析，使用SPSS 19.0軟件進行分析，分析方法為χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

PD-L1在胸腺腫瘤細胞中的表達評分結果顯示(表1，圖1～4)，B1型、B2型、B3型胸腺瘤PD-L1免疫組化染色與PD-L1+p63免疫組化雙重染色相比，在判讀難易程度上差異有顯著性(P值分別為<0.001、0.001、0.033)；胸腺癌PD-L1免疫組化染色與PD-L1+p63免疫組化雙重染色評分結果相比，差異無統計學意義(P=0.583)。

表1 兩種免疫組化染色結果判讀難易程度對比

①A①B①C②A②B②C③A③B③C④A④B④C

3 討論

胸腺屬于人體中樞免疫器官，是T細胞分化、發(fā)育和成熟的場所，胸腺瘤主要起源于胸腺上皮及淋巴細胞，PD-L1不僅在胸腺上皮源性腫瘤細胞中表達，在正常胸腺上皮細胞以及淋巴細胞中也有部分表達，這就給PD-L1在腫瘤性上皮細胞中表達的免疫組化染色的結果判讀帶來了很大挑戰(zhàn)。p63是p53抑癌基因家族的成員，在胚胎外胚層的發(fā)育和上皮組織的發(fā)育、分化以及維持細胞形態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用，p63蛋白廣泛表達于上皮組織細胞核。將p63和PD-L1兩種抗體結合起來，使用免疫組化雙重染色法，使得胸腺上皮來源的腫瘤細胞胞核呈p63免疫組化染色的紅色，細胞膜呈現PD-L1免疫組化染色的棕色，而部分淋巴細胞僅在細胞膜上有PD-L1表達，細胞核無p63表達。借助p63+PD-L1雙重免疫組化染色，我們不僅能夠判斷PD-L1在胸腺腫瘤性上皮中的表達，也能夠在一定程度上反映出在胸腺中各種淋巴細胞PD-L1的表達狀態(tài)，為今后進一步分析胸腺組織中各種細胞成分PD-L1表達狀況，與胸腺腫瘤臨床病理特點及免疫治療的相關性，提供更多的數據支持。

綜上，PD-L1+p63免疫組化雙重染色能夠很好的幫助病理醫(yī)師在判讀PD-L1陽性率的過程中，準確地識別非特異性著色。