介紹一種簡單易行的組織芯片制作方法

武振汝，陳夢琳，李 麗，石毓君，步 宏,2

組織芯片技術又稱組織微陣列(tissue microarray, TMA)，是將數十至上百個小組織塊按預先設計的陣列圖排列在同一玻片上形成矩陣的微縮組織塊。由Kononen等[1]首次提出，并證實了其實用價值。組織芯片具有體積小、易操作、信息量大等特點，該技術被廣泛應用到臨床和科學研究中。組織芯片有多種制作方法[2-4]，但鑒于設備昂貴，操作復雜，不易切片，掉片率高等問題未被推廣使用。本科室在此基礎上進行改進，總結出一種操作簡便，成本低廉，切片簡單，不易掉片，易于推廣的組織芯片制作方法，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取四川大學華西醫院生物樣本庫肝細胞癌、肝內膽管癌以及其對應的癌旁冷凍新鮮組織800例。

1.2 耗材與儀器石蠟(熔點58 ℃)、HE染液、顯微防脫玻片、組織切片機(HM355S型)等，均購自美國Thermo Fisher公司；組織芯片儀(Quick-Ray，UNITMA，中國)；特尖頭長嘴鑷子(深圳上河科技公司)。

1.3 組織芯片制作步驟

1.3.1制備供體蠟塊 冷凍新鮮組織用鑷子從凍存管中取出，在組織未完全融化時用取材刀修整成大小2 cm×1.5 cm×0.3 cm的組織塊，修整好的組織放入10%中性福爾馬林中固定48 h后，按照常規方法脫水、浸蠟、包埋。包埋好的蠟塊首先切片行HE染色，顯微鏡下觀察HE染色結果，并圈出所需病變的位置，對應切片中圈出的位置，用記號筆在蠟塊上輕輕標出穿刺點。

1.3.2制作工具準備和組織微陣列的設計 準備組織芯片制作使用的工具，骨髓穿刺針或機械組織芯片儀用于從供體蠟塊上取組織柱，刀片用于修整組織柱，長尖鑷用于夾取組織柱植入微陣列包埋模具(圖1)。

圖1 微陣列蠟塊制作工具：A.骨髓穿刺針；B.組織芯片儀取樣針；C.刀片；D.長尖嘴鑷

在電腦上設計出邊長為2 mm的正方格排列圖，用A4紙打印，用剪刀剪裁出10×12的方格圖，使剪裁出來的方格圖剛好鋪在包埋模具的底部。

1.3.3包埋模具準備 選取底面最大型號的包埋模具，包埋模具和剪裁好的10×12的方格圖在65 ℃液態石蠟中預加熱，加熱完畢后用鑷子把10×12的方格圖放置在包埋模具內部，從蠟液中取出包埋模具并傾倒出其內部多余的蠟液，包埋模具室溫冷卻后待用(圖2)。

1.3.4制作微陣列蠟塊 制作微陣列蠟塊前應先將供體蠟塊在37 ℃烤箱中預熱20 min或65 ℃烤箱中預熱3 min，再將受體蠟塊置于平整工作臺，用機械穿刺針或骨髓穿刺針打孔。打孔前先將穿刺針針芯抽出，對準欲穿刺陣點垂直向下均勻用力使針套穿透供體蠟塊，再將穿刺針套拔出，用穿刺針針芯把針帽套內組織柱輕輕推出置于潔凈平板上，用切片刀片把穿刺好的組織柱兩端修平，再用長嘴尖鑷把修好的組織塊按照預先設定的位置面朝下擺在包埋模具內，此為打好1個孔。穿刺供體蠟塊前應制作10×12表格寫入供體蠟塊編號，穿刺時按此順序進行。待包埋模具全部點陣(一般最后2或4個點不用穿刺以便定位)后(圖3)，將擺有組織柱的微陣列包埋模具小心移動到65 ℃包埋臺上。等待微陣列包埋模具底部原有石蠟融化，在此期間可以用鑷子蘸取一滴蠟液從包埋模具邊緣滴入包埋模具里面，待組織柱中的石蠟徹底融化，把微陣列包埋模具輕輕轉移到平整的冷臺上，這時微陣列包埋模具底部蠟液會很快變白凝固，同時組織柱也會被微陣列包埋模具底部的蠟液黏住，與此同時迅速用鑷子引流將蠟液灌注到微陣列包埋模具中，灌注完畢后在模具頂部加蓋包埋盒。為防止組織柱被蠟液沖倒，在灌注蠟液時需從微陣列模具的邊緣灌注并且動作要輕柔，另外需要用鑷子引流。防止芯片蠟塊底部產生空洞，微陣列模具擺上冷臺后要立馬灌注，并且最好是選取微陣列模具的兩個對角，沿著兩個對角同時灌注，最上層蓋上包埋盒，等蠟塊冷卻后從微陣列模具中取出包埋好的蠟塊，微陣列蠟塊制作完畢(圖4)。

②③④

1.3.5切片 芯片蠟塊最好用新刀片在切片機上切片，避免產生刀痕，為提高切片得片率，盡量根據蠟塊平面調整切片角度，做到少修片和連續切片。裱片操作時，要輕，速度掌握適宜，否則容易造成組織陣列偏移。另外，還要注意控制水溫在45～50 ℃。

1.3.6HE和免疫組化染色 制作完畢的組織芯片切片在65 ℃干燥箱中烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，行HE染色或EDTA微波熱修復15 min，滴加PD-L1抗體(1 ∶100稀釋)，室溫孵育1 h，PBS充分洗3次，滴加免疫組化二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，數字病理掃片儀采圖。

2 結果

2.1 芯片制作用該方法共制作肝癌和癌旁組織37個芯片蠟塊，合計2 200個組織位點，圓形芯片組織以規則的點陣方式整齊排列，芯片完整，無點陣移位現象。芯片中的組織芯點為所需要的組織形態學區域。所有列陣蠟塊均未見裂開，蠟塊表層也沒有產生空洞，組織位點排列整齊，位點無丟失。組織柱與周圍載體蠟結合緊密形成完整蠟塊，芯片蠟塊上的組織芯點排列整齊在同一平面上。芯片蠟塊易切片，通過多次驗證每個蠟塊均能切出至少300張完整的芯片切片。

2.2 芯片HE和免疫組化染色制備完畢抽取一套完整切片進行HE和免疫組化染色。HE染色結果顯示：無刀痕和脫片現象，位點組織形態及細胞結構均清晰可辨(圖5)。人膽管癌組織免疫組化PD-L1染色結果顯示：均勻表達在細胞膜，特異性強(圖6)。整個染色流程中切片無脫片，所有位點完好無損。以上結果證明，組織芯片制作技術成熟，已達到技術標準。

圖5 肝癌組織芯片HE染色

圖6 膽管癌組織芯片免疫組化PD-L1染色，EnVision法

3 討論

文獻報道的組織芯片制作方法很多，根據是否需要受體蠟塊分為兩類，需要受體蠟塊制作的組織芯片[5-6]方法繁多，但步驟繁瑣，受體蠟塊的預制孔常與組織柱大小不一致，切片時會散片、掉片。另外組織柱植入受體蠟塊后需要烤蠟塊，對烤蠟塊的溫度和時間很難把控，溫度過高或時間過久會造成蠟塊坍塌，而溫度過低或時間太短會造成切片困難。

無需受體蠟塊的組織芯片制作時需要用膠水把組織柱黏附在包埋模具底部[7-9]，過夜晾干的過程操作復雜且有組織柱傾倒風險。

本課題組借鑒前人經驗，制作的組織芯片有以下優勢；(1)無需受體蠟塊，操作簡便；(2)包埋模具底部貼有微陣列圖利于組織柱擺列整齊；(3)微陣列圖利用蠟液黏附在包埋模具底部，組織柱亦通過蠟液的黏附性植入微陣列圖上，無需膠水，節約時間并且不易產生空洞；(4)在灌注蠟液時組織柱同樣受到蠟液的黏附不易傾倒；(5)包埋出的組織芯片易于切片，產片率高并且不易掉片。因此，該方法簡單易行，成本低，易于推廣。