基于核酸適配體調控噻菁染料聚集體構建鉛離子檢測方法

趙 晗 于麗佳 吳志生 張穎琳 張華偉 師曉棟

(1.國家衛生健康委職業安全衛生研究中心，北京 102308；2.泰州醫藥高新技術產業開發區管理委員會，江蘇 泰州 225300)

鉛(Pb)在自然環境中穩定性強且不易降解，長期接觸會在人體內累積[1]，對中樞神經系統[2-4]、腎臟[5]、生殖系統[6]、骨骼[7]等造成損害。因此，開發一種快速、高效且特異性強的鉛離子檢測方法對人體健康和環境保護具有重要意義。

目前，關于重金屬檢測比較成熟的方法主要有原子吸收法[8]、原子熒光法[9]、電感耦合等離子體質譜法[10]、雙硫腙比色法[11]等，這些方法具有準確度高、選擇性好、抗干擾能力強等優點，但存在前處理復雜、需要大型儀器支持、檢測速度慢等缺點。近年來，一些依賴于納米材料或核酸適配體的新型檢測技術也常被用于重金屬檢測，主要包括電化學分析法[12]、熒光法[13]、化學發光法[14]、比色分析法[15]等。核酸適配體是一段具有三維空間結構的單鏈DNA或RNA，其可以與靶標發生特異性結合[16]。因此，構建檢測方法時，適配體可被用作一種優良的分子識別元件。由于適配體是在體外設計和篩選的，原則上任何靶標都可以有其對應的適配體，且適配體在信號傳導和化學修飾方面具有更加優良的特性，因此應用適配體技術的檢測方法往往具有更高的靈敏度。

近年來，菁染料以其良好的物理化學性質在生物檢測領域受到廣泛的關注[17-18]。菁染料是一類非常重要的有機功能染料，具有摩爾吸收系數高、光譜范圍廣、熒光量子產率高等優點[19]。相比于傳統單分子探針，菁染料超分子聚集體的優越性主要體現在：① 菁染料在溶液體系中可以自組裝形成高級聚集體；② 菁染料的聚集體對環境敏感，超分子聚集體可以被調控，自身的濃度、結構、體系中所帶的電荷和環境溫度可以調控菁染料聚集體；③ 菁染料的聚集體識別信號可以級聯放大[20]。研究擬利用Pb2+適配體和噻菁染料結合生成特異識別模塊，使其與Pb2+發生高特異性結合形成G-四鏈體結構，此G-四鏈體可將體系中以二聚體形式存在的噻菁染料(Dye2)誘導解聚為單體，比較其吸光度差異，以實現對Pb2+簡便、快速、高效的檢測，旨在構建一種快速高效檢測水中Pb2+的方法。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

鉛離子適配體：序列為T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)，生工生物工程(上海)股份有限公司；

MgCl2·6H2O、ZnCl2、NiCl2·6H2O、CoCl2·6H2O、CrCl3·6H2O、NaCl：分析純，北京化工集團有限公司；

Pb2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+標準溶液：1 000 μg/mL，中國計量學院；

2-甲基苯并[1,2-d]噻唑：薩恩化學技術(上海)有限公司；

2-(甲硫基)苯并噻唑、1，3-丙磺酸內酯：梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101K型，鄭州恒巖儀器有限公司；

旋轉蒸發器：RE-201D型，鞏義市河洛德正儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV 3600 Plus型，日本島津公司；

手提式紫外分析儀：WFH-2048型，杭州齊威儀器有限公司。

1.2 重金屬Pb2+檢測原理

T30695[21]作為Pb2+適配體，可以在Pb2+存在的情況下形成G-四鏈體。試驗研究在Pb2+存在下通過寡核苷酸序列T30695對噻菁染料的二聚體和單體進行組裝和拆卸的物理過程。該噻菁染料(Dye2)在甲醇中主要以單體形式存在，在水溶液中主要以二聚體形式存在，以T30695為模板可將Dye2的二聚體誘導成單體。基于噻菁染料在二聚體和單體之間的組裝轉化特性，通過Uv-vis光譜變化在T30695的存在下構建一種簡單的Pb2+檢測方法(見圖1)。在體系中缺乏Pb2+的情況下，Dye2的二聚體不能被T30695解聚；加入Pb2+后，二聚體可被誘導成單體與G-四鏈體相互作用。

矩形代表Dye2單體，菱形代表G-四分體圖1 重金屬Pb2+檢測機制示意圖Figure 1 Schematic diagram of heavy metal Pb2+ detection mechanism

1.3 試驗方法

1.3.2 Dye2在溶液中的聚集狀態 將3.5 μL 500 μmol/L 的Dye2儲備液分別加入到346.5 μL不同比例的甲醇—超純水混合液中(V甲醇∶V超純水分別為0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0)，室溫下避光反應2 h，測定紫外吸收光譜。

1.3.3 體系中適配體T30695濃度優化 將3.5 μL 500 μmol/L 的Dye2儲備液分別加入到不同體積的超純水中，再加入不同體積的100 μmol/L的T30695和21 μL 500 μmol/L的鉛離子溶液，室溫下避光反應2 h，測定紫外吸收光譜。

1.3.4 體系反應時間優化 向超純水中加入500 μmol/L 的Dye2儲備液3.5 μL和100 μmol/L適配體T30695 26.25 μL，再加入500 μmol/L鉛離子溶液21 μL，渦旋后立即檢測紫外吸收光譜，并每隔2 min檢測一次，直至混合液的紫外吸收光譜無變化。

1.3.5 鉛離子紫外光譜檢測 將Dye2溶解于甲醇中，制成500 μmol/L的儲備液。先向EP管中加入不同體積的超純水，再加入500 μmol/L的Dye2儲備液3.5 μL，渦旋并避光保存10 min。然后加入100 μmol/L的核酸適配體T30695 26.25 μL和不同體積的鉛離子溶液500 μmol/L，渦旋，最終混合液總體積為350 μL。將混合液于室溫下避光反應2 h，同時配制空白樣品作為比對。將混合液轉移至比色皿中，檢測300～600 nm的紫外吸收光譜。

1.3.6 離子特異性 向每個EP管中依次加入超純水，500 μmol/L 的Dye2儲備液3.5 μL和100 μmol/L適配體T30695 26.25 μL ，分別向每個EP管中加入不同的金屬離子溶液(Mg2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Cr3+、Na+、Pb2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+)，最終混合液總體積為350 μL。溶液充分振蕩，避光反應2 h，測定紫外吸收光譜。

1.3.7 回收率試驗 向每個EP管中加入稀釋1 000倍后的自來水(稀釋是為了減少自來水中其他離子對試驗的干擾)、500 μmol/L的Dye2儲備液3.5 μL和100 μmol/L 適配體T30695 26.25 μL，再加入不同濃度的鉛離子儲備液，渦旋，最終混合液總體積為350 μL。將混合液于室溫下避光反應0.5 h，檢測300～600 nm的紫外吸收光譜。

1.3.8 數據處理 采用Origin 8.5軟件對試驗數據進行處理分析。

2 結果與討論

2.1 噻菁染料Dye2的聚集狀態

由圖2可知，超純水中，Dye2在422 nm處有主要吸收峰，445 nm處有一個小肩峰，與文獻[23-25]報道相似。422 nm 處的吸收峰為二聚體峰，445 nm處為單體峰，二聚體的形成主要歸因于染料與水分子之間的氫鍵作用形成面對面的堆積模式。

由圖3可知，隨著溶劑中甲醇比例的增加，Dye2紫外吸收峰由422 nm(二聚體)向445 nm(單體)轉化，即二聚體轉變為單體；當V(甲醇)∶V(超純水)≥7∶3時，A422 nm/A445 nm幾乎不變，表明此時體系中反應已達平衡。

Chibisov等[26]研究發現，Dye2的類似物即芳環上修飾甲氧基和氯原子的化合物，單體和二聚體之間的轉化受體系溫度的影響。由圖4可知，當體系溫度為4～70 ℃ 時，二聚體與單體的吸光度比值不變，說明低于70 ℃ 時，Dye2聚集體受外界溫度影響不大，因此試驗選擇室溫條件下進行。

圖2 Dye2在不同比例的甲醇和超純水中的聚集狀態Figure 2 Aggregation state of Dye2 in different VMeOH/VH2O

圖3 不同比例的甲醇和超純水對Dye2聚集狀態的影響Figure 3 Effects of different VMeOH/VH2O on the aggregation state of Dye2

圖4 溫度對Dye2聚集狀態的影響Figure 4 Effects of different temperature on the aggregation state of Dye2

2.2 T30695濃度優化

T30695作為Pb2+的核酸適配體，在鉛離子存在條件下能形成G-四鏈體，該過程涉及到序列由單鏈轉化DNA二級結構G-四鏈體，核酸空間結構的轉化可能會影響聚集體的空間構型。由圖5可知，隨著T30695濃度的增加，Dye2在422 nm處吸收峰(二聚體)逐漸降低，445 nm處吸收峰(單體)逐漸升高。由圖6可知，A422 nm/A445 nm隨鉛離子濃度的增加逐漸降低，說明體系中T30695的濃度會影響Dye2的聚集狀態。當T30695濃度增加至3 μmol/L 時，A422 nm值達到峰值，體系主要以二聚體形式存在，當T30695濃度增加至15 μmol/L時，A422 nm/A445 nm不再改變，體系主要以單體形式存在，說明此時體系達到平衡。

2.3 體系反應平衡時間

固定鉛離子的濃度，考察不同時間點Dye2聚集體轉化情況。先檢測未加Pb2+的情況，再加入Pb2+后立即進行檢測，此后每2 min檢測一次。由圖7可知，當加入Pb2+6 min后，樣品的Uv-vis光譜再無變化，此時的A422 nm/A445 nm變化幅度較小(見圖8)，反應接近平衡，表明此方法需6 min即可檢測樣品中的Pb2+，因此，鉛離子最佳的反應時間為6 min。

圖5 T30695濃度對Dye2紫外吸收的影響Figure 5 Effects of different concentrations of T30695 on absorption spectra of Dye2

2.4 線性范圍與檢測限

在最佳試驗條件下，向體系中加入不同濃度的Pb2+標準溶液，考察Dye2聚集體轉化與鉛離子濃度的關系(圖9)。由圖9、10可知，最佳試驗條件下，當Pb2+濃度為0.25～10.00 μmol/L時，A422 nm/A445 nm與鉛離子濃度呈良好的線性關系，校正曲線方程為y=1.497-0.046x，檢出限為0.115 μmol/L。

圖7 不同反應平衡時間的Uv-vis光譜Figure 7 The Uv-vis spectra of the reaction equilibrium time

圖8 反應平衡時間對A422 nm/A445 nm的影響Figure 8 Effect of reaction equilibricum time on A422 nm/A445 nm

圖9 Pb2+濃度對聚集體的影響Figure 9 Effect of increasing Pb2+ concentration on aggregates

圖10 A422 nm/A445 nm與Pb2+濃度的關系Figure 10 The illustration is the relationship between A422 nm/A445 nm and Pb2+ concentration

2.5 特異性

為了驗證此方法的特異性，一共選擇了11種金屬離子(Pb2+，Na+，Cu2+，Cd2+，Mn2+，Cr3+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Hg2+和Fe3+母液濃度為500 μmol/L，工作液濃度為7.5 μmol/L)在最優條件下進行試驗(圖10)。將每種離子測得的A422 nm/A445 nm比值作對比(圖11)，與其他金屬離子相比，加入鉛離子的A422 nm/A445 nm顯著下降，且差異最大，表明此方法具有良好的Pb2+特異性。雖然T30695序列中含有堿基T，但是Hg2+離子沒有產生較大干擾，可能是沒有形成T-Hg-T的雙鏈構型[27]。研究[28]表明，K+可誘導T30695形成G-四鏈體，尤其是低濃度下也可形成G-四鏈體。試驗發現K+的干擾顯著降低。

圖11 體系中加入不同金屬離子的Uv-vis光譜Figure 11 The Uv-vis spectra of different metal ions added to the system

圖12 Dye2/T30695體系對Pb2+的特異性影響Figure 12 The specificity of Dye2/T30695 system for Pb2+

2.6 回收率試驗

為了測試噻菁染料Dye2的潛在應用能力，用該方法進行了回收率試驗，結果見表1。由表1可知，當加標量為2，4，5，7 μmol/L時，實際測試的樣品濃度與加入量的濃度差值較小，回收率為93.5%～101.4%，RSD<7%，具有較好的準確度和回收率，表明所建立的方法可用于自來水中鉛離子檢測。

3 結論

研究建立了一種基于噻菁染料Dye2-適配體T30695快速、高靈敏度、高特異性檢測重金屬鉛離子的方法，此方法的檢出限為0.115 μmol/L，加入鉛離子后僅用6 min即可使反應達到平衡，從而實現快速高效的檢測水中鉛離子。由于自來水中含有一定的鉀離子且適配體對其響應，因此需對自來水進行倍比稀釋以降低背景干擾。試驗所建立的方法在實際樣品檢測過程中可滿足高濃度鉛離子(>23.8 mg/L)的檢測需求，后續可通過構建雙鏈體系來降低鉀離子的干擾，同時提高其檢測限。

表1 自來水中的Pb2+回收率Table 1 The recovery results of Dye2 with addition of different concentrations of Pb2+ in tap water (n=3)