循環腫瘤細胞在乳腺癌診治中的應用

王思遠，顧佳鑫，周毅

(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院乳腺外科，哈爾濱 150001； 2.開灤總醫院血液內科，河北 唐山 063000)

近年來，乳腺癌已經成為中國女性發病率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類健康。腫瘤細胞通過血液循環向遠處擴散是乳腺癌患者轉移和復發的重要途徑。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是來源于原發腫瘤或轉移腫瘤，獲得脫離基底膜的能力并入侵，通過組織基質進入血管的腫瘤細胞，是惡性腫瘤血運轉移的重要研究指標，早在1869年，Ashworth首次提出了CTCs的概念[1]。通常血行轉移發生在癌癥晚期，但有些早期乳腺癌已有血行轉移，其癌細胞可經淋巴途徑進入靜脈[2]。因此，及時、有效地發現和干預CTCs的產生是減少乳腺癌遠處轉移、提高患者生存率和生存質量的關鍵。目前，傳統的病理學檢查是腫瘤確診的金標準，但病理學檢查為有創操作，需通過手術或穿刺等手段實施。與傳統病理學檢查相比，CTCs僅需檢測外周靜脈血液便可達到活檢的目的，原則上實現了“無創活檢”，可更加方便地監測患者的無進展生存期、總生存期和生活質量。然而，外周血中的乳腺癌CTCs數量稀少，Lee等[3]研究表明，乳腺癌患者外周血中大約每10億個有核細胞中僅可見1枚CTC。因此，如何快速、精準地檢測CTCs十分重要。現就CTCs在乳腺癌診治中的研究進展予以綜述。

1 CTCs的生物學特性及檢測方法

1.1CTCs的生物學特性 CTCs是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，主要分為4類，即單個上皮性CTCs、干細胞性CTCs、間質性CTCs和CTCs簇。探究乳腺癌CTCs的生物學特征有助于了解腫瘤的發生、發展，指導臨床研究新的抗癌策略。CTCs產生的機制目前尚不明確，可能與上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)相關。腫瘤細胞在進入血液循環時可能發生EMT，增強了腫瘤細胞的侵襲能力，在EMT過程中，上皮細胞擺脫了細胞間黏附性、平面-頂部基質極性及缺乏運動性等分化特征，上皮相關基因下調，間充質基因上調，獲得了間充質的特性[4]，并進入血液循環。在血液循環中，CTCs不僅以游離的單個細胞形式出現，也可聚集成團形成CTCs細胞簇。盡管每天有大量的腫瘤細胞由原位脫落入血形成CTCs，但僅有極少的CTCs可以存活，并發展成新的轉移灶，其中大多數CTCs在外周血循環過程中被免疫系統殺傷或凋亡。調控CTCs凋亡的相關通路及機制尚不清楚，Bonnomet等[5]研究表明，乳腺癌細胞通過EMT增強CTCs的侵襲、遷移能力誘導相關蛋白酶參與細胞外基質的降解，從而促進細胞進入血液循環、侵襲組織。

在臨床上，關注CTCs特殊的生物學特征有助于早期診斷原發腫瘤及轉移灶。研究表明，CTCs的形成時間早于影像學和臨床癥狀的出現，CTCs不僅從實體腫瘤病灶脫落進入血液循環，還有可能在影像學發現宏觀腫瘤之前就已出現在血液循環中[6]。因此，與傳統的影像學檢查和腫瘤標志物的檢測相比，檢測CTCs可以更早地發現乳腺癌的轉移和復發。此外，CTCs還可以替代傳統采集腫瘤組織方法行相關病理實驗及測試，如基因點突變、人類表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因擴增、拷貝數的變異、DNA甲基化及蛋白質組學等分析研究[7-11]。

1.2CTCs的檢測方法 理想的檢測方案需要有效、準確、迅速地檢測并分離存在于大量正常細胞中的腫瘤細胞。CTCs分選是各種CTCs檢查的第一步，通過陽性或陰性篩查和富集，而后鑒定并區分CTCs和正常細胞。應用CTCs特異性表達的上皮型標志物[如上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、上皮鈣黏素、細胞因子]和間質型標志物(如神經鈣黏素、波形蛋白和鋅指轉錄因子蛋白)，不僅可以對CTCs進行數量測定，還可以聯合多種標志物對CTCs進行形態學或生物學分析[12]。完善CTCs的檢測手段可以有效地將其應用于腫瘤的早期診斷，快速評估腫瘤轉移的風險，為早期乳腺癌針對性治療提供依據[13]。不同的檢測技術可以捕獲不同類型的CTCs，并且它們對不同類型腫瘤細胞的敏感性和特異性也不同。常規的檢測手段(如CellSearch系統)需根據血液中的細胞大小分離出所需要的細胞團，然后對這些細胞團進行鑒定，并區分具有EpCAM+/肌酸激酶(creatine kinase，CK)陽性/4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)陽性/CD45-特征的細胞和正常細胞(表1)。

表1 CTCs檢測方法

2 CTCs在乳腺癌中的臨床意義

2.1CTCs在乳腺癌分型中的意義 目前臨床上針對乳腺癌的免疫組織化學主要評定標準是評估腫瘤中雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、HER2和Ki67的表達水平。乳腺癌的分子分型分為Luminal A型、Luminal B型、ERBB2+型和Basal-like型，HER2陽性乳腺癌患者因具有更高的惡性程度、更快的疾病進展速度和更早的轉移及復發而受到了廣泛的關注。Schindlbeck等[21]將乳腺癌患者常用的免疫組織化學標志物(如ER、PR和HER2)在CTCs上進行了檢測，結果發現，不同患者或乳腺癌亞型之間存在很大的差異。腫瘤的異質性決定了CTCs不同的分子表型，Ignatiadis等[22]通過熒光原位雜交分析CTCs中HER2的表達狀態，并與原位腫瘤進行了比較，結果發現，HER2陰性乳腺癌患者體內的CTCs呈HER2過表達。目前尚不明確HER2表達的變化是否與對原發腫瘤中HER2狀態的評估不準確有關，亦可能與HER2陽性的亞基最初被“隱藏”在HER2陰性原發性腫瘤的轉移性生長中有關。Aktas等[23]對96例乳腺癌患者使用基于聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)的AdnaTest?，結果發現，CTCs上的HER2表達情況可預測乳腺癌轉移灶上HER2的表達情況，可為制訂個體化治療提供重要信息。然而，隨著對CTCs研究的深入，發現CTCs上HER2狀態會隨著時間的推移而改變，并可能取決于治療方法。例如，Bidard等[24]研究調查了抗HER2抗體——曲妥珠單抗對消除HER2陽性CTCs的作用，認為在HER2陽性的乳腺癌中CTCs的總體發生率較低可能是由于先前接觸過抗HER2治療。同樣，Rack等[25]報道了抗HER2治療可以消除骨髓中HER2陽性擴散的腫瘤細胞，由此推測，抗HER2治療有顯著降低CTCs數量的作用。因此，監測CTCs的數量及狀態對HER2陽性的乳腺癌患者具有重要的臨床意義，但目前尚無統一的CTCs診斷標準。另外，在轉移性乳腺癌患者中，CTCs似乎比原位腫瘤存在更大程度的HER2陽性率，表明它們具有惡性潛能(表2)。

2.2CTCs在乳腺癌療效評估中的意義 目前乳腺癌的主要治療手段仍是手術治療，通過全身治療(術前新輔助化療、術后放化療、內分泌治療)減慢晚期乳腺癌進展，最大限度地提高患者日常生活質量并延長總生存期，同時最大限度地降低治療不良反應發生率，CTCs有可能作為液體活檢更好地指導乳腺癌的治療并評估預后。Maltoni等[31]研究發現，早期乳腺癌患者體內CTCs的陽性率為9.4%～48.6%，并且認為血液中CTC≥1個/7.5 mL是一個閾值，可預示早期復發和總生存期降低。Rack等[32]對2 026例乳腺癌患者進行常規輔助化療，發現CTCs陰性患者的治療效果較好，同時在多因素分析中發現，CTCs的存在與乳腺癌無病生存率相關(P<0.001)，CTCs計數可作為獨立預后參考。Bredemeier等[33]通過使用多標記實時熒光定量PCR芯片對CTCs進行全面的分子層面特征描述，通過評估治療干預過程中CTCs分子譜的變化進而評估患者對治療的反應。大量數據表明，在40%～80%的乳腺癌患者外周血中可檢測到CTCs[24-28]。由此可見，CTCs數量的變化可能反映某種全身療法的反應，同時，由于CTCs是無創的收集方法，較易在治療過程中實現持續監測，為療效評估提供了可靠依據。但是，由于目前科研進展有限，CTCs能否成為臨床獨立判斷療效的因素還有待商榷。Azim等[34]研究發現，在HER2+早期乳腺癌患者中，CTCs數值與病理完全緩解發生率比例較低；Bidard等[35]研究收集了1 574例將進行新輔助化療和1 200例將進行手術的早期乳腺癌患者的血液，結果發現，新輔助化療前25.2%的患者檢測出1個或多個CTCs，但其計數對病理完全緩解無影響。因此，隨著科研進展，對乳腺癌患者采用CTCs檢測可以推測乳腺癌患者的治療效果。

表2 CTCs與乳腺癌免疫組織化學表達比例

2.3CTCs在判斷乳腺癌預后中的意義 通過對乳腺癌患者外周血中CTCs的監測，不僅可以預測放化療的效果和預后，還可以監測術后腫瘤有無復發、轉移。Mikhitarian等[36]對215例T1～T3期乳腺癌患者的外周血樣本進行分析，利用EpCAM、CK19、癌胚抗原和乳球蛋白等多種常規腫瘤標志物進行綜合檢測，發現患者外周血中的CTCs計數升高與乳腺癌組織學分期的差異有統計學意義(P=0.031 5)，CTCs計數增加可能是患者預后較差的指標。一項多因素前瞻性分析在新治療方案開始前和首次隨訪時檢測了177例轉移性乳腺癌患者外周血CTCs的水平，結果發現，CTCs數量與患者生存質量相關，其中CTCs<5個/7.5 mL外周血患者無進展生存期和總生存期顯著縮短(無進展生存期：2.7個月比7.0個月；總生存期：10.1個月比18個月，P<0.05)，5個CTCs/7.5 mL外周血的閾值水平可用于預測轉移性乳腺癌患者的臨床預后[30]。梁志洪等[37]對135例乳腺癌患者進行CTCs測定，發現CTCs的陽性率與臨床TNM分期、HER2和Ki-67指數等常見預測乳腺癌預后指標具有相關性。這些研究證實了CTCs計數與乳腺癌已知不良預后標志物的相關性，說明將乳腺癌CTCs計數作為獨立預后標志物具有重要臨床意義。此外，Budd等[38]對138例轉移性乳腺癌患者進行CTCs檢測，并與影像學檢查進行對比分析，結果顯示，影像學陰性而CTCs≥5個/7.5 mL外周血的患者生存率較CTC<5個的患者低(中位生存時間：3個月比25.9個月)，而影像學陽性但CTCs<5個/7.5 mL外周血的患者生存率較CTCs≥5個/7.5 mL患者高(中位生存時間：19.9個月比6.4個月)。因此，CTCs檢測較常規影像學檢查具有更高的敏感性，能及時、有效地判斷乳腺癌的預后情況。

3 小 結

高特異性和高敏感性的CTCs檢測可以作為乳腺癌患者的預后參考，但由于缺乏標準化的CTCs分離程序和表征，且技術手段不足，限制了目前CTCs的研究。此外，CTCs之間仍存有差異，未來需要進一步對乳腺癌CTCs進行深入研究，特別是在乳腺癌的早期診斷、免疫治療、預后評估、預防復發等方面，應以更加完善的方案監測CTCs。另外，CTCs的精準篩選可以使評估患者的個體化差異、分析耐藥機制等研究變得簡單而靈活，同時將基礎醫學與臨床應用相結合，探索新的抗癌策略，最終提高乳腺癌患者的生存率，改善生活質量。