糖尿病大血管病變多組學研究進展

趙大可，胡大勇

(同濟大學附屬第十人民醫院腎臟風濕科，上海 200072)

糖尿病是胰島素分泌缺陷或胰島素利用障礙引起的一種以血糖升高為主要特征的內分泌代謝性疾病[1]。國際糖尿病聯合會報告稱，隨著人們生活水平的提高，糖尿病患病人數逐年遞增，2015年已確診糖尿病患者達4.15億，預計2040年將上升至6.42億[2]，而中國糖尿病患者人數居世界首位，糖尿病成為亟須解決的重大公共衛生問題[3]。糖尿病可引起多種并發癥，其中糖尿病血管病變最常見。糖尿病血管病變包括大血管病變和微血管病變，糖尿病大血管病變指糖尿病引起的主動脈、冠狀動脈、肢體外周動脈等發生粥樣硬化以及由此引發的各種心血管疾病；糖尿病微血管病變指糖尿病所致的微血管基底膜增厚，伴透明樣物質沉積，臨床上主要包括糖尿病視網膜疾病、糖尿病腎病以及糖尿病神經系統病變，70%～80%的糖尿病患者直接死因為糖尿病大血管并發癥[4-5]。有效控制血糖可以降低糖尿病微血管病變的發生率，但對減少大血管病變發生和進展的作用有限[6]，該現象提示糖尿病大血管病變由多方面因素共同作用所致。由于糖尿病大血管病變早期患者無明顯的臨床癥狀，早發現、早干預成為降低糖尿病大血管病變危害的重要原則，但糖尿病大血管病變的病理損傷機制極為復雜，且目前分子損傷機制目前尚不清楚[7-8]。近年來，隨著高通量分子生物技術的迅速發展，基因組學、轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學研究不斷增多，為糖尿病大血管病變的診療靶點以及分子機制研究提供了大規模的可用數據[9-11]，通過生物信息學分析和系統生物學揭示了常規方法無法發現的一些疾病發生發展的潛在致病靶點以及早期疾病發生的生物標志物，為有效控制糖尿病大血管病變進展提供了新的診療思路[12]。現就近年來糖尿病大血管病變的發生發展機制在基因組學、轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學方面的研究進展予以綜述。

1 糖尿病大血管病變的基因組學研究

基因組學是一門對一個生物體全基因進行表征、量化并研究基因間相互關系及對生物體影響的遺傳學分支學科[13]。近年來，隨著人類全基因組測序以及DNA微陣列等高通量技術的發展，單核苷酸多態性和基因組拷貝數變異在全基因組及大規模人群的篩查成為可能，同時促進了全基因組關聯研究(genome wide association study，GWAS)的開展[14]。糖尿病大血管病變主要病理表現是動脈粥樣硬化及其所引起的血管損傷后遺癥[15-16]。目前對于糖尿病大血管病變基因組學的研究主要集中在易感基因的篩選驗證以及GWAS。

1.1糖尿病大血管病變的易感基因多態性 糖尿病大血管病變與基因多態性相關，目前認為參與糖尿病大血管病變的相關基因包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)基因、載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因以及炎癥細胞因子基因。

基因組學研究已經確定了動脈粥樣硬化的多個潛在遺傳生物標志物，其中調節血容量和血管阻力的RAAS的基因多態性研究最受關注。糖尿病患者動脈粥樣硬化進展與血管緊張素轉換酶插入/缺失(I/D)多態性(rs4646994)DD基因型相關[17]。Saitou等[18]的研究顯示，在222例2型糖尿病患者中，DD基因型患者的動脈粥樣硬化進展更快。此外，一項納入超過5 000名受試者的Meta分析表明，血管緊張素轉換酶基因I/D多態性與動脈粥樣硬化進展相關[19]。同屬于RASS的血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)基因的多態性與糖尿病血管病變之間的相關性也受到重視，一項對普通人群AGT基因多態性與動脈粥樣硬化關系的Meta分析發現，AGT rs699(M235T)多態性是動脈粥樣硬化發生的危險因素[20]。既往研究證實，AGT rs4762(T174M)和AGT rs699(M235T)與糖尿病的發生相關[21]，但有關AGT基因多態性在2型糖尿病動脈粥樣硬化中作用的研究仍十分有限。Al-Najai等[22]的臨床研究發現，AGT rs699與糖尿病患者的心血管病變風險相關。血管緊張素Ⅱ1型受體阻滯劑能有效減緩糖尿病患者動脈粥樣硬化進展[23]，但有關其基因多態性與動脈粥樣硬化相關性的研究仍較少。一項前瞻性臨床研究發現，血管緊張素Ⅱ1型受體rs5186是冠狀動脈粥樣硬化進展的標志物[24]。

體內血脂異常是糖尿病患者心血管風險增高的主要原因之一，因此脂代謝相關基因多態性對糖尿病血管病變的影響一直受到關注。ApoE有3個等位基因(ApoEε2、ApoEε3、ApoEε4)，其中ApoEε4等位基因與總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平有關。研究發現，攜帶ApoEε4等位基因是糖尿病患者動脈粥樣硬化的致病因素，頸動脈內膜中層厚度是檢測動脈粥樣硬化存在和發展的指標，可預測無癥狀糖尿病患者的未來心血管事件[25]。一項納入超過5 000 例病例樣本的Meta分析發現，ApoEε2、ApoEε3、ApoEε4等位基因均與頸動脈內膜中層厚度的發生相關，且ApoEε4對頸動脈內膜中層厚度的影響最顯著[19]。

炎癥因子在動脈粥樣硬化各階段均起著重要作用，包括內皮細胞損傷、免疫細胞募集、泡沫細胞形成及破裂、斑塊形成及血栓形成。動脈粥樣硬化和糖尿病的病理生理機制過程均與白細胞介素(interleukin，IL)-6以及腫瘤壞死因子-α相關。Papaoikonomou等[26]首次發現了IL-6(C-174G)可作為糖尿病大血管損傷的標志物，并證實攜帶C等位基因糖尿病患者更易發生大血管并發癥。此外，腫瘤壞死因子-α(G308A)也可作為糖尿病大血管損傷的標志物[27]，且攜帶A等位基因可能與糖尿病心血管病變進程相關[28]。

1.2GWAS 自2005年GWAS誕生以來，基因組學得到了快速發展，通過對大規模的群體DNA樣本進行全基因組分析，尋找與疾病相關的遺傳基因。基于GWAS技術的糖尿病相關基因的初期篩選往往針對單一疾病，Morris等[29]為了探索糖尿病的潛在易感基因位點，建立了超過14萬人的糖尿病基因數據庫，成功篩選出10個新的糖尿病易感基因，但糖尿病是極其復雜的系統性疾病，往往伴隨諸多并發癥，最嚴重的是糖尿病大血管并發癥，基于GWAS聯合分析糖尿病與冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)的數據庫成為近年糖尿病基因組學研究的新方向。GWAS薈萃分析發現，糖尿病和CAD的易感基因有重疊，且重疊的共表達基因與糖尿病心血管并發癥存在潛在相關性[30]。Zhang等[31]通過分析糖尿病與CAD的GWAS信息，確定了33個糖尿病易感基因位點和34個CAD易感基因位點，其中重疊易感基因位點有9個，7個基因為首次報道，且這7個易感基因可能是糖尿病大血管病變新的潛在致病靶點。隨著信息學技術的發展，對糖尿病大血管病變基因組學的研究以及基于GWAS重疊共表達潛在致病基因的探索將逐漸深入，雖然目前已經開發的多種生物信息學工具仍不能有效全面地管理和解釋GWAS數據[30]，但在揭示糖尿病大血管病變新的易感基因位點的生物學意義方面有很大的應用前景。

2 糖尿病大血管病變的轉錄組學研究進展

轉錄組是在整體水平上研究細胞中所有基因轉錄及轉錄調控規律的學科，該概念最初由Velcuescu等[32]在研究酵母基因表達時提出，有助于了解疾病發生發展過程中基因的表達情況，進而從轉錄水平揭示生命過程的代謝網絡及調控機制[33]。機體內存在一些不能編碼蛋白的基因，這些基因的轉錄產物稱為非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，主要包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)、環狀RNA(circular RNA，circRNA)[34]。

2.1LncRNA與糖尿病血管病變 LncRNA參與的糖尿病大血管病變主要包括糖尿病引起的血管炎癥以及其他心血管病變，參與這些病變的細胞主要是巨噬細胞、平滑肌細胞以及內皮細胞。通過轉錄組學分析糖尿病與非糖尿病小鼠模型中的骨髓巨噬細胞分離發現，糖尿病小鼠模型巨噬細胞中E330013P06 lncRNA上調；并通過巨噬細胞過表達E330013P06發現，炎癥因子以及炎癥因子的應答能力也隨之升高，提示E330013P06 lncRNA參與巨噬細胞介導的糖尿病大血管炎癥病變[35]。糖尿病大血管病變往往伴隨血管平滑肌細胞的病變，研究表明，lncRNA-Ang362可通過誘導miR-221、miR-222的表達促進血管平滑肌增殖[36]。此外，內皮細胞發育也與lncRNA相關，PUNISHER lncRNA可通過調控內皮細胞的發育以及脂蛋白的攝取能力調控糖尿病的內皮細胞損傷[37]。

2.2miRNA和circRNA與糖尿病大血管病變 miRNA在動脈粥樣硬化中起關鍵作用[38]，但miRNA在糖尿病條件下的作用尚不清楚，Reddy等[39]對糖尿病小鼠血管平滑肌中miRNA進行高通量測序，確定了135種差異明顯的miRNA，這些miRNA可能會促進血管平滑肌功能障礙，其中miR-504的差異最明顯，通過靶向調節miR-504可為糖尿病血管并發癥的治療提供新的策略。近年來，具有高度保守結構的circRNA在糖尿病血管病變中的作用也受到關注，circRNA具有miRNA的結合位點，可作為miRNA“海綿”與相應靶基因結合，并抑制靶基因的表達[40]。孟哲穎等[41]通過對糖尿病心肌病變小鼠心肌細胞中circRNA進行功能聚類分析顯示，miR-142-3p可通過調控lncRNA和circRNA參與糖尿病心肌病的發生。裴曉艷[42]發現circRNA-001175上調不僅對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞具有保護作用，還增加了高糖狀態下人臍靜脈內皮細胞的成血管能力，因此circRNA-001175在一定程度上可作為糖尿病血管疾病發生的生物標志物。

3 糖尿病大血管病變的蛋白質組學研究進展

糖尿病大血管病變的病理機制主要包括一氧化氮生物利用度降低，活性氧類、血栓前因子的產生增加。蛋白質往往是基因功能的表現，因此可通過糖尿病大血管病變與正常血管蛋白質表達譜的差異探尋糖尿病大血管病變損傷標志物，可在一定程度上反映疾病的病理狀態變化。目前，對于糖尿病大血管病變的蛋白質組學研究主要集中于血漿生物標志物及其機制通路，人體血漿中有90萬種蛋白質，依靠傳統實驗室技術根本無法驗證，而蛋白質組學能夠整體分析一個細胞、組織或整個生物體的所有蛋白質[43]，并可同時鑒定和篩選龐大數量的蛋白質[44]。

3.1糖尿病大血管病變的細胞模型蛋白質組學 內皮細胞損傷是糖尿病大血管病變的主要始動因素之一[45-46]，所以對糖尿病狀態下內皮細胞蛋白組學的研究可能有助于糖尿病大血管病變早期損傷標志物的發現，糖尿病晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)與血管內皮AGEs受體(receptor-AGEs，RAGE)結合導致內皮細胞損傷[47-48]。Banarjee等[49]首次采用SWATH(Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions)技術對糖基化人血清白蛋白處理的人臍靜脈內皮細胞進行定量蛋白質組學研究，共鑒別出283種差異表達蛋白，其中161種蛋白表達豐度增加、123種蛋白表達豐度下降，這些差異蛋白主要參與了內皮細胞凋亡、細胞黏附、凝血等內皮損傷通路；通過蛋白互作網絡分析發現，高表達RelA基因處于網絡的關鍵位置，RelA是核因子κB的p65亞單位，而核因子κB是RAGE下游的主要調節因子，提示RAGE參與了血糖誘導的內皮細胞損傷，敲除糖尿病伴動脈粥樣硬化小鼠模型RAGE基因后，小鼠動脈粥樣硬化斑塊有所改善[50]。

3.2糖尿病大血管病變的體液蛋白質組學 人臍靜脈內皮細胞具有易獲得、分離和培養的特點，故更常用，但其往往來源于免疫優勢的胎兒組織，并不能真實地反映糖尿病的炎癥特性和病理機制特點。有研究者通過收集2型糖尿病和非糖尿病頸動脈內膜切除術患者血漿，試圖尋找更符合人體的糖尿病大血管損傷標志物，通過雙向電泳與液相色譜-串聯質譜法共發現16種差異明顯的蛋白，隨后通過蛋白-蛋白互作網絡分析發現，玻璃粘連蛋白(Vitronectin)是糖尿病血管損傷的潛在關鍵節點[51]。免疫印跡實驗證實，糖尿病血管中Vitronectin的表達增加，但未說明Vitronectin的細胞內定位及其在蛋白互作網絡中的分子機制。與血漿蛋白質組學相比，尿液蛋白質組學逐漸受到關注，尿液收集的無創性在糖尿病大血管病變的診斷及預后分析方面具有明顯優勢[52]。與正常人群相比，糖尿病大血管并發癥患者的病死率和致殘率均較高，但由于病例標本收集困難，相關研究較少，且糖尿病大血管病變動物模型的造模技術尚不成熟，也是糖尿病大血管病變組織蛋白質組學研究的難點之一。

4 糖尿病大血管病變的代謝組學研究進展

糖尿病患者體內血管組織不能有效調節細胞內的血糖水平，進而導致心血管疾病的發生。當機體發生疾病或受到外界干預后，代謝組學可通過核磁共振或質譜技術等檢測機體內的小分子代謝物(分子量<1 000)，并描述這些代謝物質變化規律，從而準確描述機體在疾病狀態時的代謝變化。一項關于人類糖尿病的蛋白質組學研究顯示，25%的差異蛋白質被歸為細胞代謝通路[53]，提示蛋白質組學和基因組學需要結合代謝組學的研究結果來完整闡述糖尿病大血管病變發生發展的分子及代謝機制。

4.1糖尿病大血管病變的氨類代謝組學 糖尿病發病風險與支鏈氨基酸的異常代謝相關，支鏈氨基酸與胰島素抵抗呈正相關[54]，支鏈氨基酸可作為糖尿病進展的生物標志物[55]。然而，單一氨類分子代謝途徑的研究往往不能有效發現新的代謝途徑，通過代謝組學圖譜分析可以更全面地發現新的代謝通路，Yuan等[56]應用DiART(deuterium isobaric amine reactive tag)標記聯合液相色譜-質譜聯技術檢測了糖尿病大血管病變細胞模型的細胞內胺衍生物的代謝變化，通過編碼標記胺的同位素并聯合液相色譜-串聯質譜法技術發現，暴露于短期(0～6 h)高糖培養基的內皮細胞數量并沒有變化，但是細胞內丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺的變化顯著，繼續暴露于高糖環境的第7天，內皮細胞數量明顯減少，細胞內21種胺類代謝物發生明顯變化，包括氨基己二酸鹽、胱硫醚、次牛磺酸和脯氨酸，這些胺代謝產物大多屬于氧化應激氨基酸代謝產物[57]，可見該氧化代謝途徑可能在高糖引起的內皮細胞氧化損傷中具有一定作用。

4.2糖尿病大血管病變的脂類代謝組學 胰島素抵抗是糖尿病發生的主要原因之一。有研究表明，胰島素抵抗與體內脂肪堆積和脂肪分布相關[58]，因此脂類代謝異常在糖尿病并發癥發生中起重要作用。Filla等[59]運用毛細管液相色譜-串聯質譜技術檢測糖尿病伴主動脈狹窄小鼠模型的主動脈組織代謝圖譜，共鑒定出719種具有明顯倍數變化的代謝產物，其中48條代謝通路含有兩個以上差異明顯的代謝產物，且維生素B6、丙酸酯和丁酸酯代謝通路所含差異明顯代謝產物最多，但這些代謝途徑在既往糖尿病血管損傷代謝途徑的研究中鮮有提及[60]。相關研究發現，色氨酸代謝重要產物犬尿氨酸與胰島素分泌以及機體糖耐量相關[61]，故推測維生素B6可能對糖尿病大血管病變的發生發展起作用。目前，糖尿病血管損傷的代謝途徑研究主要集中在多元醇、AGEs等氧化應激損傷通路，但針對這些途徑的治療在長期糖尿病血管損傷中的效果并不明顯，該研究可能通過非靶向代謝組學方法為糖尿病大血管損傷的治療提供了新的治療靶點和途徑。

4.3糖尿病大血管病變的糖類代謝組學 3-羥基丁酸作為一種體內葡萄糖利用障礙時的急救性能量來源，在糖尿病并發癥的研究中一直備受關注。有研究發現，3-羥基丁酸可通過核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體抑制動脈粥樣硬化的炎癥反應[62]。Omori等[63]通過毛細管電泳-飛行時間質譜技術對糖尿病合并冠心病患者血清進行代謝組學分析，共鑒定出104種代謝物，其中7種代謝物差異明顯，包括戊二酸、氨基葡萄糖、胸腺嘧啶、3-羥基丁酸、肌酸、2-氨基異丁酸、次黃嘌呤，提示這些代謝物在糖尿病合并冠心病的發生發展中起著一定作用，其中氨基葡萄糖和3-羥基丁酸判別CAD發生的靈敏度和特異度更高，而氨基葡萄糖在之前對動脈粥樣硬化的研究中一直存在爭議，有研究提示，氨基葡萄糖可通過抗炎作用抑制動脈粥樣硬化的發生發展[64]，但另有研究發現，氨基葡萄糖可以加速動脈粥樣硬化的進展[65]。

5 小結與展望

近年來，隨著組學技術及生物信息學的發展，糖尿病大血管病變的多組學研究逐漸深入，未來基于多組學聯合分析的糖尿病大血管病變精準診療成為必然趨勢，但仍然存在諸多問題：首先，人們對糖尿病亞臨床血管病變的重視程度有待提高，在發病初期發現糖尿病大血管病變并予以控制將對患者預后起到積極作用。其次，GWAS拓寬了糖尿病血管病變的相關基因位點數量，但目前易感基因多態性在臨床實踐中的適用性仍有限，且已知基因位點只能解釋糖尿病血管病變的部分遺傳變異，仍需要更多臨床樣本的驗證。

各種組學技術并非相互獨立，將獨立組學數據整合，形成機體代謝物的網絡圖，可以更加精準定位糖尿病血管病變的關鍵功能基因的表達模式以及作用通路。在未來糖尿病大血管病變的多組學研究中，不僅需要更多臨床樣本的驗證，還需要開發和驗證分層風險模型，該模型可以綜合來自基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的高通量組學數據，通過生物信息學分析最終獲得糖尿病血管病變的易感基因、機制通路、疾病分期標志物的綜合信息。利用這些信息不僅可以對高發人群進行早期精準地干預，還有助于開展糖尿病大血管病變的精準診療。