Hsa-miR-335-5p及其靶基因預測肝癌肝移植術后腫瘤復發的生物信息學分析

羅曼曼，馮智軍，任志檢,3，曾蕾,3，徐雪蓮,3，李玉民

(1.蘭州大學第二臨床醫學院，蘭州 730030； 2.蘭州大學第二醫院腫瘤外科病區，蘭州 730030；3.甘肅省消化系統腫瘤重點實驗室，蘭州 730030)

肝細胞肝癌通常繼發于慢性肝病，如乙型和丙型肝炎、酒精和非酒精性肝炎、代謝綜合征等，是最常見的肝臟惡性腫瘤之一，約占肝臟惡性腫瘤的90%[1]。目前，肝癌的外科治療方式主要為肝移植和手術切除[2]，術后復發一直是影響患者外科術后生存的關鍵因素，文獻報道肝癌肝切除術后5年復發率超過70%，肝移植術后1年和5年復發率約為15%和30%[3]，中位復發率高達16%，且復發時間大多在肝移植后16個月內[4]。也有文獻報道，肝癌肝移植術后低風險復發患者的中位生存時間為75.2個月，顯著高于中、高風險復發患者(11.3個月和3.3個月)[5]。因此，探索肝癌肝移植術后復發的腫瘤標志物對于優化患者治療方案和延長生存時間具有重要預測價值。

目前，隨著對肝癌轉錄組學研究的不斷深入，微RNA(microRNA,miRNA)逐漸受到關注。miRNA是短的非編碼RNA，長度僅為20～24 nt，其通過影響mRNA的穩定性和翻譯，參與多細胞生物中基因表達的轉錄后調控[6]。miRNA參與肝癌調控的多個方面，包括增殖、凋亡、侵襲、轉移、血管生成、耐藥和自噬等[7]。既往研究表明[8-9]，hsa-miR-335-5p在肝癌中被認為是一種主要起抑癌作用的miRNA，其在肝癌組織和細胞系中低表達，而其過表達可以抑制肝癌細胞的增殖和遷移，但是否影響肝癌肝移植后腫瘤復發目前尚不明確。因此，本研究基于公共基因表達數據庫，通過生物信息學分析，為hsa-miR-335-5p是否參與肝癌肝移植術后腫瘤復發、能否作為臨床監測肝移植術后腫瘤復發的生物標志物尋找證據。

1 材料與方法

1.1芯片數據來源 在PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)數據庫中檢索hsa-miR-335-5p和肝癌的相關文獻，在基因表達數據庫GEO(Gene Expression Omnibus)[10](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中以“肝細胞肝癌”“肝移植術”和“miRNA”為關鍵詞進行檢索，物種限定為“人”，篩選并確定目標數據集后利用GEO2R分析工具獲得目標數據集中肝移植術后腫瘤復發與未復發的差異miRNA，差異miRNA的篩選符合以下條件：|logFC|>1且P<0.05，并用R軟件繪制火山圖來可視化差異基因的整體表達情況。

1.2Hsa-miR-335-5p基本信息 使用PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、miRBase[11](http://www.mirbase.org/)、UCSC (http://genome.ucsc.edu/)等在線數據庫查找hsa-miR-335-5p的物種保守性、堿基序列、染色體序列等基本信息。

1.3Hsa-miR-335-5p靶基因預測 收集miRTarBase[12](http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)和DIANA-TarBase v7.0[13](http://www.tarbase.com/)數據庫有實驗數據支持的miRNA及其靶基因，預測hsa-miR-335-5p靶基因，在GEPIA[14](http://gepia.cancer-pku.cn)數據庫中選擇ANOVA方法用于配對肝癌和正常組織，以|logFC|>1且P<0.01為篩選條件，獲得肝細胞肝癌中表達上調的差異基因，三者通過Funrich[15]工具取交集獲得共表達差異基因。

1.4共表達靶基因的基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析 Enrichr[16]數據庫是一個在線的綜合性的基因富集分析工具，運用Enrichr數據庫對共有的靶基因進行GO分析和KEGG分析，篩選出P<0.05且顯著富集的GO及KEGG通路名稱。

1.5共表達靶基因的蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及關鍵基因分析 STRING[17](https://string-db.org/)數據庫是一個包含960萬種蛋白和1 380萬種蛋白質之間相互作用的數據庫，可應用于2 031個物種。通過STRING構建共有靶基因的PPI網絡，然后將其互作數據導入Cytoscape[18]，利用Cytohubba插件、Degree法篩選出得分位于前20的靶基因作為關鍵基因，并將數據結果進行可視化。

1.6關鍵基因與肝癌預后生存分析 GEPIA[14]是一個國人開發的癌癥基因組圖譜數據庫的可視化在線網站，使用GEPIA[14]數據庫分析關鍵基因在肝癌組織和正常組織中的表達水平，繪制關鍵基因的總生存期(overall survival，OS)和無病生存期(disease free survival，DFS)曲線并進行Log-rank檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1微陣列數據集 檢索PubMed中的文獻得到hsa-miR-335-5p參與肝癌調控作用，通過篩選后確定GSE30297為研究的目標數據集，包含97例樣本，其中61例為肝癌患者肝移植后腫瘤復發樣本，36例為肝癌患者肝移植后腫瘤未復發樣本，平臺號為GPL8786，平臺信息為艾菲矩陣公司多物種miRNA-1陣列(Affymetrix Multispecies miRNA-1 Array)，種屬為人。通過GEO2R分析篩選出miRNA上調612個，下調13個，見圖1。

圖1 GSE30297數據集差異miRNAs火山圖

2.2Hsa-miR-335-5p序列保守性分析 Hsa-miR-335-5p定位在染色體7q32.2，利用PubMed、miRBase、UCSC等工具分別下載并分析人(hsa)、小鼠(mmu)、牛(bta)等10個物種的hsa-miR-335-5p成熟序列，hsa-miR-335-5p序列中“UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUG”23個堿基序列在多物種中高度保守，見表1。

表1 Hsa-miR-335-5p在10個物種中堿基序列

2.3Hsa-miR-335-5p的靶基因預測 通過miRTarBase數據庫預測hsa-miR-335-5p的靶基因共有2 368個，TarBase數據庫預測共有2 208個。從GEPIA中篩選出肝細胞肝癌下調基因2 207個，三者取交集后得到185個差異靶基因，見圖2。

圖2 Hsa-miR-335-5p差異表達的靶基因韋恩圖

2.4Hsa-miR-335-5p共表達靶基因的GO分析及KEGG通路分析 GO可分為細胞組成、生物過程和分子功能。使用Enrichr數據庫對hsa-miR-335-5p的185個靶基因進行GO和KEGG分析，見圖3。參與的細胞組成有分泌顆粒腔、細胞質囊泡腔、液泡腔、質膜跨度成分、血小板α顆粒等；生物學過程涉及炎癥反應、調節細胞增殖、內皮細胞遷移、細胞過程的積極調控、基因表達的正調控等；分子功能參與細胞因子活性、趨化因子活性、主要組織相容性復合體Ⅱ類蛋白復合物結合、轉錄共激活因子結合、轉錄激活子活性及RNA聚合酶 Ⅱ 轉錄因子結合等。KEGG通路有過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、化學致癌作用、凋亡、腫瘤壞死因子信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路等。

GO：基因本體；KEGG：京都基因與基因組百科全書；CC：細胞組成；BP：生物過程；MF：分子功能

2.5Hsa-miR-335-5p靶基因PPI網絡構建及關鍵基因篩選 將185個共表達靶基因輸入STRING數據庫，獲得PPI網絡圖(圖4)，下載互作數據，并導入Cytoscape軟件，篩選出評分前20個靶基因即關鍵基因：VEGFA、CXCL9、CCL20、SPP1、CXCL2、FOS、G6PD、CCL19、SCD、SQLE、CYP7A1、TSLP、PYGB、CYP26A1、NPY1R、GABBR1、ALDOA、ACSL1、CDA、SQSTM1，見表2。

PPI：蛋白互作

表2 20個關鍵基因列表

續表2

2.6Hsa-miR-335-5p的關鍵基因與肝癌的預后生存分析 將20個關鍵基因通過GEPIA數據庫進行肝癌相關的生存分析，結果顯示：肝癌和正常組織中VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD的表達比較差異有統計學意義(P<0.05)，且與肝癌患者的預后生存顯著相關(P<0.05)，見圖5～8。

VEGFA：血管內皮生長因子A；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數；num(N)：正常組織的病例數；5a：VEGFA與OS的關系；5b：VEGFA與DFS的關系； 5c：VEGFA在肝癌與正常組織中的表達

SPP1：分泌型焦磷酸蛋白1；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數；num(N)：正常組織的病例數；6a：SPP1與OS的關系；6b：SPP1與DFS的關系；6c：SPP1在肝癌與正常組織中的表達

PYGB：糖原磷酸化酶B；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數；num(N)：正常組織的病例數；7a：PYGB與OS的關系；7b：PYGB與DFS的關系；7c：PYGB在肝癌與正常組織中的表達

G6PD：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；OS：總生存期；Precent survival：生存率；Months：月；DFS：無病生存期；LIHC：肝細胞肝癌；num(T)：肝癌組織的病例數；num(N)：正常組織的病例數；8a：G6PD與OS的關系；8b：G6PD與DFS的關系；8c：G6PD在肝癌與正常組織中的表達

3 討 論

肝移植是目前有望治愈肝癌的有效手段，但由于復發率較高，患者預后差，肝癌肝移植術后復發成為亟待解決的問題。以往多以原發腫瘤的數量級大小、血管侵犯程度、生物學分級、組織學分級等粗略預測患者的預后，近年來尋找能夠反映肝癌肝移植術后腫瘤復發有效、安全且簡便的生物標志物成為研究熱點之一。

隨著對miRNA研究的深入，人們開始關注miRNA在各種疾病中的作用，特別是在腫瘤中的作用，使miRNAs成為新的治療方法和檢測預后的工具和靶點[6]。miRNA通過與信使RNA(messenger RNA,mRNA)結合，在細胞發育、分化和增殖過程中發揮核心作用，抑制mRNA翻譯或使其降解。人類肝臟中定量表達最多的miR-122有望用于肝癌的早期診斷[19]；miR-18a、miR-199a-5p、miR-424表達水平與肝癌肝移植術后復發有關[20-21]；Han等[22]認為使用miRNA的表達模式可準確地預測肝癌肝移植術后復發。有研究發現，hsa-miR-335-5p在肝癌組織中下調，肝癌組織中其甲基化水平明顯高于癌旁組織，且有遠處轉移的肝癌組織中hsa-miR-335-5p表達水平降低[23]；circ-0005075是一類新定義的內源性非編碼RNA成員之一，在肝癌中表達上調可促進腫瘤進展，hsa-miR-335-5p作為肝癌侵襲和轉移的抑制因子，可與circ-0005075相互作用從而影響肝癌細胞的進展[24]；敲除hsa-miR-335-5p能夠減弱肝癌細胞對索拉菲尼的敏感性[25]；hsa-miR-335-5p可能參與乙型肝炎病毒相關肝癌的發生發展[26-27]；hsa-miR-335-5p表達水平低的肝癌患者表現出不良的臨床病理特征(如高甲胎蛋白值、血管侵犯、肝硬化、腫瘤體積大)，且這些患者對動脈栓塞治療反應及預后較差[28]。本研究選取的數據集樣本來源是肝癌肝移植術后患者，運用生物信息學分析得到hsa-miR-335-5p在肝癌肝移植術后腫瘤復發組和未復發組的表達比較差異有統計學意義，提示hsa-miR-335-5p在肝癌肝移植術后患者中也發揮重要作用。為進一步了解hsa-miR-335-5p在肝癌肝移植術后患者中的作用，本研究使用軟件預測其靶基因并篩選出20個關鍵基因，之后通過GEPIA數據庫分別驗證這20個關鍵基因，發現VEGFA、SPP1、G6PD、PYGB與肝癌患者術后生存顯著相關。

VEGFA屬于血小板源性生長因子/血管內皮生長因子家族，誘導血管內皮細胞的增殖和遷移。其在肝癌中過表達，與肝癌患者的臨床病理因素(如增殖、血管侵犯、腫瘤多樣性)有關，是肝癌細胞在低氧條件下生存的必要條件之一，還與肝癌患者不良預后有關。組蛋白脫乙酰基酶6可預測肝癌肝移植術后患者的無復發生存期，敲低組蛋白脫乙酰基酶6在體內和體外能夠明顯上調VEGFA，有利于原發性肝癌的血管生成[29]。有研究表明，miRNA可以調控肝癌肝移植術后患者體內的VEGFA表達，從而影響患者生存狀況[20]，但hsa-miR-335-5p調控VEGFA與肝癌肝移植術后腫瘤復發的關系還不明確。

SPP1又稱為骨橋蛋白，能促進VEGF依賴的腫瘤生長和血管生成，可以預測肝癌肝移植術后患者的DFS[30]；其還能作為結直腸癌肝轉移患者的預后生物標志物[31]；Cabiati等[32]研究發現，SPP1在肝癌組織中高表達，在血漿和組織中的水平隨著患者臨床嚴重程度的增加而升高，在肝移植術后6個月SPP1的血漿水平下降，由此推測肝癌肝移植術后患者體內hsa-miR-335-5p上調引起SPP1表達水平下降進而抑制腫瘤復發，但具體機制還需驗證。

Hsa-miR-335-5p的靶基因PYGB是催化糖原降解的決定因素，既往文獻報道PYGB是人癌相關抗原的成分之一，在肝癌中高表達，與肝癌的發生進展有關[33]；Tashima等[34]研究表明PYGB在結直腸癌的癌變過程中起重要作用，是結直腸癌的一種新的早期生物標志物；沉默PYGB能夠抑制前列腺癌細胞的生長，促進細胞凋亡[35]；Zhou等[36]研究發現miRNA可與PYGB相互作用，影響卵巢腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，可作為未來治療卵巢腫瘤的新靶點。

G6PD在葡萄糖代謝中起關鍵作用，G6PD缺乏癥被認為是活體肝移植的禁忌證，但Reddy等[37]認為若G6PD缺乏癥患者的供體適合捐贈，圍手術期溶血的風險低且臨床環境安全，可以考慮肝移植；G6PD參與肝癌中磷酸戊糖途徑和生物合成的關鍵調控步驟，敲除G6PD可抑制肝癌的進展，降低肝癌細胞的遷移和侵襲能力，還能通過干擾素途徑使乙型肝炎病毒復制減少500%，G6PD可作為評估肝癌風險和預后的新的生物標志物[38-39]。G6PD作為hsa-miR-335-5p的靶基因，參與肝癌肝移植術后腫瘤復發的機制有待進一步驗證。

以上研究表明，VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD基因低表達時可抑制肝癌的進展，且VEGFA和SPP1之間還能夠相互影響。4個關鍵基因的生存分析結果顯示，VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD低表達時肝癌患者的OS和DFS高于高表達組，且在肝癌和正常組織中表達差異有統計學意義，由此推測hsa-miRNA-335-5p調控VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD可作為監測肝癌肝移植預后的潛在標志物，并為研究肝癌肝移植術后腫瘤復發提供了新思路。

綜上所述，VEGFA、SPP1、PYGB、G6PD是hsa-miRNA-335-5p可靠的靶基因，與肝癌肝移植術后患者的預后存在顯著相關性，是肝癌肝移植術后腫瘤復發可靠的調控機制。雖然本研究選取的數據集較少，預測miRNA靶基因的工具少，使用的各種數據庫并不是時時更新或對基因信息注釋不完善，可能造成假陽性的結果，但在一定程度上也能為研究提供初步依據和新思路。目前miRNA及其靶基因協同作用與肝癌肝移植術后復發關系的基礎和臨床研究仍較少，值得進一步探究，為臨床監測肝癌肝移植術后復發尋求新的靶點，做出正確的治療決策。