內質網應激對肝泡型包蟲病部分炎癥介質的影響

李 姚，王靖超，袁加琪，溫 浩，周 瀛，樊海寧，王志鑫

1 青海大學附屬醫院 肝膽胰外科，西寧 810000；2 新疆醫科大學第一附屬醫院 消化血管外科中心肝膽包蟲外科，烏魯木齊 830000

棘球蚴病存在于我國西部多個省份，中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所對我國青海、四川、云南等9個省抽樣調查發現，流行區域的患病率為0.28%[1]。肝泡型包蟲病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)可以經淋巴道和血管轉移到腹膜后和遠隔器官如腦、肺等，故有“蟲癌”之稱[2-3]。該病目前仍是世界范圍內一個重要的公共衛生問題[4-5]。

肝包蟲病發病初期癥狀不明顯，癥狀出現后病情會快速加重[6-7]。目前切除手術是治療肝包蟲病的最佳手段，藥物治療的效果有限。因此，尋找到新的治療方法和藥物非常重要。有研究[8]表明，硼替佐米(bortezomib，BTZ)對包蟲病小鼠的原頭節和后絳幼蟲有殺滅作用，其作用機制與內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)有關。本項課題初步研究HAE中ERS與部分炎癥介質的相關性，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年6月—2019年9月因HAE在青海大學附屬醫院接受肝臟部分切除術的患者15例，切除HAE病灶邊緣帶作為AE組，同期肝臟正常組織15例作為對照組。

1.2 檢測指標 采集AE組病灶邊緣帶和正常肝組織，并收集一般臨床資料，采用Western Blot檢測病灶邊緣帶和正常組織中蛋白激酶R樣激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancerbindingproteinε, CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteine-containing aspartate-specific proteases 12,caspase-12)和葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP-78)的表達情況，實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測病灶邊緣帶和正常組織中IL-6、IL-9、TNF的表達。

1.3 主要儀器及試劑 主要儀器有冷凍離心機(heal force，neofuge 13R)、轉印電泳儀(北京六一儀器廠，DYCZ-40D)、qRT-PCR儀(ABI，Stepone plus)、超微量分光光度計(Thermo，Thermo)。主要試劑包括RIPA裂解液、50*cooktail、PMSF、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、HRP標記二抗、RNA提取液、FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)等。

1.4 檢測方法和步驟

1.4.1 Western Blot法檢測步驟 將肝組織塊洗滌后剪成小塊置于勻漿管中徹底勻漿。將勻漿完成的樣本管取出，進行冰浴、震蕩確保組織完全裂解。離心后收集上清，即為總蛋白溶液。配制分離膠，加入TEMED后搖勻灌膠。凝固后開始電泳，然后轉膜。加入一抗后孵育過夜，洗滌加入二抗，孵育、洗滌后經化學發光、顯影和定影，使用Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值，即蛋白質表達水平。

1.4.2 相關蛋白和炎癥因子mRNA表達水平的檢測 取100 mg組織，加入到有1 ml Trizol Reagent的勻漿管中。離心后取上清。加入三氯甲烷，充分混勻，靜置。再次離心后管底的白色沉淀即為總RNA。然后逆轉錄成cDNA，用PCR儀進行擴增。目的基因表達陽性的標本熒光定量擴增曲線呈S形，從qRT-PCR儀系統中讀取CT值。結果處理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)-CT(內標基因，待測樣本)，B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內標基因，對照樣本)，K=A-B，表達倍數=2-K。基因引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 倫理學審查 本研究方案經由青海大學附屬醫院倫理委員會審批，批號：P-SL-2019072，所有納入患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 ERS相關蛋白表達水平 AE組PERK、CHOP、caspase-12和GRP-78表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 兩組間ERS相關蛋白表達水平的比較

2.2 ERS相關指標mRNA的表達水平 AE組的PERK、CHOP、caspase-12和GRP-78的 mRNA表達水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表3)。

表3 兩組間ERS相關指標mRNA表達水平的比較

2.3 炎癥介質mRNA的表達水平 AE組IL-1β、IL-6、TNF的 mRNA表達水平較對照組明顯增高，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表4)。

表4 兩組間相關炎癥介質mRNA表達水平的比較

2.4 ERS蛋白與炎癥介質相關性 Pearson相關分析ERS相關蛋白與IL-1β、IL-6、TNF的相關性，結果顯示PERK、CHOP、capcase12、GRP-78與IL-6、IL-1β、TNF具有正相關性(P值均<0.05)(表5)。

表5 ERS相關蛋白與炎癥介質的相關性

3 討論

棘球蚴感染導致嚴重的慢性人畜共患寄生蟲疾病，在畜牧養殖地區廣泛流行[9]。此病仍是一個世界公共衛生問題[10]。阿苯達唑是目前唯一用于包蟲病術前術后的口服藥物[11]，由于其療效差、并發癥多，找到新的治療藥物成為重要問題。據Nicolao等[12]研究，硼替佐米對多房棘球蚴蟲具有高水平的殺傷作用。硼替佐米作為一種用于骨髓瘤化療的蛋白酶體抑制劑[13-14]，雖然有研究[15]表明其對多房棘球蚴蟲具有殺傷作用，但此藥物仍然不能在HAE臨床治療中使用，這還需要更多進一步的研究。

內質網是哺乳動物細胞中必不可少的細胞器，其膜結構占細胞內膜的1/2，在內膜系統中占有非常重要的地位[16]。損傷因子作用于內質網，造成蛋白質加工、運輸障礙或鈣吸收、釋放障礙，導致各種蛋白質的重疊、折疊式蛋白堆積和細胞內的鈣離子不均衡，從而激活重疊的蛋白反應，即非折疊蛋白反應。而非折疊蛋白反應信號通路通過細胞凋亡途徑引起細胞損傷甚至死亡[17-18]。內質網膜上有3種能夠感受到腔內未折疊蛋白堆積的特殊蛋白質感受器，分別為PERK、IRE-1、ATF6[19]。PERK是一種跨膜蛋白，具有N端應力傳感結構域和胞質激酶結構域[20]。IRE1是最保守的壓力傳感器,有兩個亞型(IRE1α、IRE1β)存在于哺乳動物[21]。ATF6是一種跨膜蛋白，具有胞質bZIP轉錄因子域，包含兩種哺乳動物亞型ATF6α、ATF6β[22]。當其激活時,ATF6α通過蛋白酶裂解S1P、S2P,釋放胞質片段,遷移到核調節基因轉錄[23]。雖然內質網在肝細胞中的作用已被廣泛研究，但其在肝臟非實質部分的功能尚未被探索[24]。因此，研究可能影響肝臟炎癥和細胞ERS的相關因素具有重要意義。

在HAE中包蟲的存活和侵襲能力可能與非折疊蛋白反應有關[25]。為了保護肝臟免受包蟲的損害可以恢復正常的蛋白穩態。一些治療方案可以轉錄重組內質網，以繼續保護機體不暴露于折疊不當的分泌蛋白，而不是導致過度的ERS引起的炎癥和細胞死亡。因此，在肝臟系統生理和病理反應之間保持平衡穩態，以內質網為治療靶點是目前可能的藥物治療方向。

肝臟的損傷和破壞是由于細胞過多的死亡和肝組織中基質的過量損失而表現出來的。胞體壓力本身促進了ERS，與炎癥反應有進一步的相互作用，可以通過炎癥反應促進細胞外基質的水解。但是具體的調節機制不明確。

在本研究中，基于相關研究分析了HAE邊緣帶組織中ERS表現的變化。結果顯示，在AE組肝臟邊緣的PERK、CHOP、caspase-12、GRP-78的表達水平明顯高于對照組，表明HAE的肝組織中ERS的表現明顯更為活躍，提示ERS的過度活化與HAE的發生發展有關。各種炎性細胞浸潤肝細胞及其周圍組織，分泌大量的炎癥介質使炎癥反應級聯放大。IL-1β、IL-6、TNF是活性化后浸潤到肝組織的炎癥介質。在AE組中IL-1β、IL-6、TNF的分泌量明顯高于對照組，表明HAE病情的發展以及對肝細胞和肝組織的破壞與炎癥介質有關。ERS相關蛋白PERK、CHOP、caspase-12、GRP-78與炎癥介質IL-1β、IL-6、TNF呈正相關性，提示ERS和HAE炎癥反應存在一定程度的相關，ERS促進了HAE的發展。因此筆者認為，HAE中ERS的激活與炎癥介質的活性化存在相關性，ERS的過度激活能夠改變部分炎癥介質的分泌來加劇肝損傷，具體機制有待進一步研究?？笶RS治療有望成為HAE藥物治療的潛在方式。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：李姚、王靖超、袁加琪、溫浩、周瀛、樊海寧、王志鑫負責課題設計、資料分析；李姚、王靖超負責收集數據與撰寫論文；李姚、王靖超、王志鑫參與修改論文；溫浩、周瀛、樊海寧、王志鑫責擬定寫作思路，指導撰寫論文并最后定稿。