牛蛙血細胞核酸和脊髓運動神經細胞的顯色觀察*

徐本錦，劉 玲，宣 焱，杜 淼

山西醫科大學汾陽學院醫學檢驗系，山西呂梁 032200

核酸的細胞化學染色是利用化學試劑與核酸分子反應生成帶顏色的產物，從而達到對細胞內DNA和RNA定位和定性的目的，是細胞遺傳學研究的重要手段。1924年有研究者發明了DNA顯色的經典方法——福爾根反應[1]。該反應還可用于DNA的化學計量測定[2]、區分腫瘤性質和判斷病變程度等[3]。甲基綠-派洛寧染色已被廣泛用于細胞內DNA和RNA的顯示[4]。

牛蛙具有血細胞大[5-6]、肌肉發達、性情溫和等特點，是了解肌肉、呼吸系統、心臟和循環系統[7]結構特征的良好材料。本研究對牛蛙血細胞中的核酸和脊髓運動神經細胞進行了顯色，對實驗的注意事項進行了分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1一般材料 健康牛蛙數只，染色缸，載玻片，蓋玻片，鑷子，剪刀，香柏油，擦鏡紙。

1.2儀器與試劑 儀器：普通光學顯微鏡，恒溫水浴箱。主要試劑：甲基綠-派洛寧混合液，95%乙醇，1%亮綠染液，1 mol/L HCl，Schiff試劑，1%甲苯胺藍染液。

1.3方法

1.3.1牛蛙血細胞DNA的福爾根反應顯色 具體實驗步驟包括：(1)取材。麻醉牛蛙，將其置于一白瓷盤中，腹面朝上，沿著尾部向頭部方向依次剪開皮膚和肌肉，找到心臟。剪開心包膜，使心臟完全顯露出來，然后在心臟上剪一小口。(2)涂片。取一張干凈的載玻片，輕輕蘸取心臟血，以45°夾角在另一張干凈的載玻片上輕輕向前推，即可做成血涂片，自然晾干。(3)水解。將血涂片置于室溫下的1 mol/L HCl中水解2 min，然后置于60 ℃的1 mol/L HCl中水解8 min，再在室溫下的1 mol/L HCl中水解2 min。(4)染色。將血涂片用小流量的水沖洗，除去多余的HCl，然后在血涂片上滴加一層Schiff試劑，染色30 min，再用小流量的水沖洗，然后放入1%的亮綠染液中復染30～60 s，小流量的水沖洗后晾干。(5)鏡檢。先在低倍鏡下找到符合預期實驗結果的區域，然后在高倍鏡下觀察。(6)拍照。拍照記錄不同放大倍數的實驗結果。

1.3.2牛蛙血細胞DNA和RNA的甲基綠-派洛寧染色 具體實驗步驟包括：(1)取材，同上。(2)涂片，同上。(3)固定。在晾干的血涂片上滴加一層95%乙醇，室溫固定5 min，然后吸去乙醇再放置5 min。(4)染色。在血涂片表面滴加1層(3～4滴)甲基綠-派洛寧染液，染色20 min后用小流量的水沖洗掉多余染液，再用吸水紙吸去多余水分。(5)鏡檢。先在低倍鏡下找到符合預期結果的區域，然后在高倍鏡下仔細觀察細胞核與細胞質的顏色。(6)拍照。拍照記錄不同放大倍數的顯色結果。

1.3.3牛蛙脊髓運動神經細胞的甲苯胺藍染色 具體實驗步驟包括：(1)取材。取小段高位脊髓，置于載玻片上用鑷子或牙簽將其搗碎。(2)染色。滴加數滴甲苯胺藍染液，染色5 min左右，然后用小流量的水洗去多余染液。(3)壓片。蓋上蓋玻片，用拇指擠壓使脊髓壓為一薄層。(4)鏡檢。先在低倍鏡下找到符合預期結果的區域，然后在高倍鏡下仔細觀察細胞形態特征。(5)拍照。拍照記錄不同放大倍數的染色結果。

2 結 果

2.1血細胞DNA的福爾根反應顯色 結果顯示，福爾根反應后細胞核呈紫紅色，細胞質呈綠色(圖1A)。隨著復染時間的延長(50～60 s)，細胞質呈暗綠色(圖1B)。當復染時間為30 s或更短時，細胞質變為淺綠色(圖1C)。在顯微鏡下，還經常可以看到有些細胞核是紅色的，有些細胞核顏色很淺或幾乎沒有紅色(圖1D～E)。這是由于局部水解不充分或不完全造成的。另外，當復染時間大于60 s時，可以看到部分細胞質顏色變為淺海綠色，細胞核的紫紅色也被一定程度覆蓋了(圖1F中的黑色箭頭)。因此，福爾根反應顯色血細胞DNA的最佳條件為室溫水解2 min，60 ℃水解8 min，再室溫水解2 min，Schiff試劑染色30 min，亮綠復染40 s。

注：A 為亮綠復染約40 s(×400)；B為亮綠復染50～60 s (×400)；C為亮綠復染約30 s(×400)；D為亮綠復染約30 s，并且部分水解不充分(×100)；E為水解不充分(×400)；F為亮綠復染60 s或更長時間(×400)。

2.2血細胞DNA和RNA同時顯色 血細胞中的DNA和RNA經甲基綠-派洛寧染色后，可以看到細胞核變成了藍色，細胞質變為粉紅色(圖2A)或深紫色(圖2B～D)。

2.3脊髓運動神經細胞的染色觀察 牛蛙的高位脊髓經甲苯胺藍染色后，可以看到單極形(圖3A，以及圖3B右上角的黑色實線箭頭)、雙極形(圖3A，以及圖3B左下角的黑色實線箭頭)或多極形(圖3A，以及圖3C～D的黑色實線箭頭)分枝且具有神經纖維的形態較大的運動神經細胞(深藍色)。還可以觀察到呈圓形、數目較多、形態較小的細胞，為神經膠質細胞(圖3A、E，以及圖3B～D、F中的黑色虛線箭頭)。此外，在運動神經細胞中還能看到染色很深的核仁(圖3B～D)。

注：A、C、D為×400放大倍數下的視野；B為×100放大倍數下的視野。

注：A為×100放大倍數下的視野；B～E為×400放大倍數下的視野；F為×1 000放大倍數下的視野。

3 討 論

細胞化學是研究細胞內化學成分及其在細胞活動中的變化和定位的學科。核酸定位和細胞化學染色是生命科學，特別是遺傳學研究的重要手段。DNA細胞技術在評估腫瘤侵襲性方面發揮著重要作用[8]，可以為腫瘤病理分級和臨床分期提供有價值的信息。細胞化學染色不僅有助于研究細胞的代謝活動、生理功能，而且對生理和病理情況下血細胞化學成分的變化，各種類型血細胞的鑒別，某些血液病的診斷、治療及發病機制的探討均有重要意義。

福爾根反應是一種經典的DNA顯色方法，是DNA的特異性反應，核染色質和染色體能夠被顯色，而含有核糖核酸的核仁和細胞質福爾根反應為陰性。本研究首先利用福爾根反應的原理對牛蛙心臟血細胞中的DNA進行了顯色分析。結果顯示，血細胞核呈紫紅色，亮綠復染后細胞質呈綠色(圖1A)、暗綠色(圖1B)或淺綠色(圖1C)。通過對亮綠復染時間的優化，確定了牛蛙血細胞DNA顯色的最佳條件：室溫水解2 min，60 ℃水解8 min，再室溫水解2 min，Schiff試劑染色30 min，亮綠復染40 s。多年來，關于福爾根反應的影響因素，雖然已有多個報道，但筆者根據自身經驗，提出了4點注意事項：(1)血涂片的制作。以45°夾角在另一張干凈的載玻片上輕輕向前推，夾角過大或過小，都會影響血細胞在玻片上的分布、數量和形態。切勿來回多次推片，防止玻片之間的切割作用造成血細胞破裂，影響后續實驗。(2)HCl水解的時間。福爾根反應的一個關鍵步驟是DNA經弱酸水解，釋放出游離的醛基。如果水解不充分，嘌呤堿與脫氧核糖之間的糖苷鍵未斷裂或斷裂不完全，導致形成的游離醛基變少，進而反應變弱(圖1D～E)。另外，如果水解時間過長，則可能使DNA和組蛋白過度降解，也會導致反應變弱，甚至出現陰性結果。(3)Schiff試劑的質量。Schiff試劑的質量直接影響著DNA的呈色反應，應選用質量好的堿性品紅來配制Schiff試劑，并注意避光保存，防止因氧化變紅而失效。(4)復染時間。亮綠復染的最適時間為40 s(圖1A)。若復染時間太短，則亮綠著色太淺，導致細胞質呈現淺綠色(圖1C)。如果復染時間太長，細胞質的顏色就會變成淺海綠色，細胞核的紫紅色也會被一定程度覆蓋(圖1F)。福爾根反應有助于人們理解DNA在生物學和遺傳學中的作用。此外，Schiff試劑在組織化學研究中被引入，為其他醛基染色劑的開發打下了基礎。

核酸的定量檢測在研究細胞生長、腫瘤生物學和系統發育關系等方面具有重要意義。甲基綠是一種單組分的核染料，其染色機制涉及靜電作用和非離子相互作用[9]。這種非離子反應可能是由于染料嵌入了DNA的嘌呤和嘧啶堿之間造成的[10]。由于具有陽離子性質，甲基綠被認為可與帶負電荷的DNA結合，能夠實現對組織或細胞內DNA含量的可靠評估。派洛寧Y是一種陰離子染料，不僅能夠染色RNA、彈性纖維和肥大細胞顆粒，還能對硫酸黏蛋白進行染色[11]。本研究通過甲基綠-派洛寧染色，對牛蛙血細胞中的DNA、RNA進行了定位分析。結果顯示，細胞核呈藍色，細胞質被染成粉紅色(圖2A)或深紫色(圖2B～D)。本實驗有3個需要注意的地方：(1)固定時間。一般情況下用95%的乙醇固定10 min。實際操作時，先固定5 min，然后吸掉乙醇，再等待5 min。(2)染色時間以20 min為宜。(3)多余染料的清洗。多余的染料要用小流量的水沖洗，水流速度不宜過快，否則細胞質的顏色會變淺(圖2C)。甲基綠-派洛寧染色法還可用于評估癌前和癌變過程中細胞核和核仁的變化[12]。此外，也可作為常規蘇木素-伊紅(HE)染色的輔助手段來診斷惡性腫瘤[9,13]和檢測細胞凋亡[14-15]。

甲苯胺藍染色顯示脊髓運動神經細胞具有特異性強，無背景著色，結果穩定的特點[16]。本研究用甲苯胺藍染液對牛蛙的脊髓運動神經細胞進行顯色觀察，在視野中可見許多染色較深的呈單極形、雙極形和多極形分枝的運動神經細胞(圖3A～D)。這些細胞個體較大，細胞中央較膨大，稱為胞體。此外，運動神經細胞還具有細長的纖維狀結構，能夠接收和傳導刺激，稱為神經纖維。運動神經細胞中也可見深藍色的核仁(圖3B～D)。還可以看到許多染色較深的小細胞，即神經膠質細胞。本實驗有兩個需要注意的地方：(1)取材。取牛蛙高位脊髓，因為高位脊髓中的運動神經細胞數目較多，而低位脊髓中幾乎看不到運動神經細胞，只能看到數量較多的神經膠質細胞。(2)壓片。一定要確保脊髓被搗碎，然后壓為一薄層，否則，只能看到很少的細胞或者幾乎看不到細胞。

綜上所述，牛蛙是研究核酸在血細胞中的定位和顯示神經系統特性的良好材料。在福爾根反應中引入亮綠復染并優化染色時間是一種較好的方法，提高了細胞核與細胞質顏色的對比度，有利于進行后續的核酸定量分析。甲基綠-派洛寧染色能同時對DNA和RNA進行定位和定性分析。1%的甲苯胺藍染色能很好地顯示牛蛙高位脊髓中運動神經細胞的形態。本文系統地分析和討論了這3個實驗的影響因素，對實驗過程中可能出現顯示不佳的結果也進行了呈現和說明，并提出了操作過程中的注意事項。本研究結果可靠，可重復性好，對實驗教學、科學研究以及臨床應用都具有一定的理論和實踐意義。