沉默Apaf-1基因對氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞線粒體凋亡通路的影響①

張彐寧 高維娟 周曉紅 靳曉飛

(河北中醫學院，河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，石家莊 050091)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病治療過程中常見的病理損傷，如何減輕該損傷已成為臨床及科研領域的研究重點。再灌注導致的病理損傷機制主要為細胞凋亡、氧自由基生成過多、Ca2+超載、自噬等[1-2]。細胞凋亡作為腦缺血后再灌注引發二次損傷的重要作用機制，主要表現形式包括內源性線粒體凋亡途徑和外源性死亡受體途徑，其中線粒體凋亡通路是再灌注凋亡發生的主要途徑[3-4]。凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)是線粒體凋亡通路中連接上下游調控因子的關鍵中間蛋白，對細胞凋亡調控發揮關鍵作用[5]。研究發現，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中，通過藥物干預抑制Apaf-1表達可顯著抑制細胞凋亡，減輕腦組織損傷[6]。但在細胞水平的相關研究較少，而采用基因沉默靶向抑制Apaf-1表達，準確觀察其對腦缺血再灌注線粒體凋亡通路的影響研究更少。本研究采用PC12細胞建立氧糖剝奪/復氧復糖細胞模型，模擬神經細胞體外缺血再灌注損傷環境，靶向抑制Apaf-1蛋白表達，在細胞水平探討Apaf-1對氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞線粒體凋亡通路的影響，為腦缺血再灌注損傷的靶向治療提供新的思路和實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)購自BOSTER公司，經NGF誘導后具有神經元特性。

1.1.2主要試劑與儀器 opti-MEMⅠ培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；脂質體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；Apaf-1-siRNA(廣州銳博)；CCK-8試劑盒(北京莊盟)；TUNEL試劑盒、AnnexinV-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)；Bax、Bcl-2抗體(武漢Servicebio公司)；Apaf-1、caspase-9、caspase-3單克隆抗體(美國CST公司)；DMEM培養基、Earle′s平衡鹽溶液(安徽雷根)。SW-CJ-ID型超凈工作臺(蘇州凈化)；3111型CO2培養箱、 Multiskan FC型酶標儀、3131型三氣培養箱(美國Thermo公司)；多功能成像系統(Vilber)；Axio Observer 7型倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)；FC 500 MCL型流式細胞儀(Beckman)。

1.2方法

1.2.1細胞培養與Apaf-1轉染 PC12細胞采用含10%胎牛血清+1%雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM培養基置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養，細胞融合度達80%以上時進行傳代。采用對數生長期PC12細胞進行轉染，轉染前1 d，采用含10%胎牛血清不加雙抗的培養基以5×105個/孔接種于6孔板，次日細胞密度達30%～50%時進行轉染，具體操作按照siRNA說明書進行。轉染6 h后更換為DMEM培養基，轉染后24 h于倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(Apaf-1表達水平)，48 h后采用Western blot檢測轉染效率，設置NC-siRNA、Apaf-1-siRNA1、Apaf-1-siRNA2、Apaf-1-siRNA3 4組篩選合適的siRNA干擾Apaf-1基因，轉染成功后造模。

1.2.2實驗分組與模型建立 實驗分為3組：正常組(Control)、模型組(Model)及Apaf-1基因沉默組(Apaf-1-siRNA)。 Control組細胞不做任何處理，其余各組氧糖剝奪2 h、復氧復糖24 h造模。造模過程：取對數生長期PC12細胞，去除正常培養基，PBS清洗2遍，更換為無糖Earle′s平衡鹽溶液，37℃、飽和濕度、94%N2+1%O2+5%CO2培養2 h，即氧糖剝奪2 h，Model組和Apaf-1-siRNA組更換為正常培養基，放入CO2中繼續培養24 h，即復氧復糖24 h。

1.2.3熒光標記的siRNA檢測Apaf-1轉染效率 轉染前1 d，將PC12細胞以5×105個/孔接種于6孔板，細胞密度達30%～50%時進行轉染，用opti-MEMⅠ培養基冰上稀釋lipo 2000 Cy3-siRNA貯存液，室溫靜置5 min，混勻，室溫靜置20 min，加入6孔板，置于CO2培養箱中培養24 h，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。

1.2.4Western blot檢測siRNA干擾對PC12細胞Apaf-1表達的影響 轉染48 h后，造模后取出各組PC12細胞，按比例加入細胞裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，300 mA恒流1.5 h濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Apaf-1(1∶500)一抗，4℃孵育過夜，TBST洗5 min×3次，洗去一抗，加入相應二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗5 min×3次，ECL化學發光液浸泡，多功能成像系統掃描成像，Image J軟件分析條帶，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達。

1.2.5CCK-8檢測細胞存活率 采用96孔板培養細胞，除Control組外，其余各組均進行氧糖剝奪2 h、復氧復糖24 h造模處理，按比例加入CCK-8試劑，置于CO2培養箱孵育50 min，酶標儀檢測450 nm處OD值。

1.2.6TUNEL染色檢測各組細胞凋亡指數 采用12孔板培養細胞爬片，造模后取出各組細胞爬片，固定、破膜，PBS清洗爬片，甩掉清洗液，除Control組外，其余各組滴加50 μl TUNEL反應混合液(TdT∶dUTP=1∶9)，Control組僅加入50 μl dUTP，37℃避光孵育10 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片，隨機選取6個視野觀察各組細胞凋亡情況。陽性細胞(凋亡細胞)細胞核為棕黃色。

1.2.7流式細胞術檢測各組細胞凋亡率 各組細胞培養、造模后，收集培養基，胰蛋白酶(不含EDTA)消化細胞，預冷PBS洗3次，1 500 r/min離心5 min，加入100 μl 1×Binding Buffer緩沖液重懸細胞，加入FITC和PI各5 μl，室溫避光孵育15 min，篩網過濾，加入400 μl 1×Binding Buffer緩沖液，FC 500 MCL型流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.8免疫熒光染色檢測Bax/Bcl-2比值 取各組細胞爬片清洗固定，0.2%Triton X-100破膜，山羊血清封閉0.5 h，甩干封閉液，加入Bax與Bcl-2一抗混合液，濕盒內4℃過夜，PBS洗去一抗，室溫封閉二抗混合液1 h，洗去二抗，滴加DAIP染液，室溫孵育15 min，防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析Bax與Bcl-2熒光強度。

1.2.9Western blot檢測Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表達 造模完成后分別收集細胞上清，消化裂解，提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，90 V恒壓電泳分離蛋白，300 mA恒流轉膜1.5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBST洗去一抗，室溫孵育二抗1 h，TBST洗去二抗，化學發光液浸泡3 min，多功能成像系統掃描成像，Image J軟件分析條帶，以β-actin為內參，計算目的條帶、內參相對表達。

2 結果

2.1熒光標記的siRNA檢測Apaf-1轉染效率 siRNA轉染PC12細胞24 h后，Apaf-1-siRNA組85%以上細胞表達紅色熒光，見圖1。

2.2siRNA干擾對PC12細胞Apaf-1表達的影響 與對照組相比，轉染Apaf-1-siRNA1、Apaf-1-siRNA2、Apaf-1-siRNA3的各組細胞Apaf-1蛋白表達降低，且以Apaf-1-siRNA1組降低最為顯著(P<0.05)。因此采用Apaf-1-siRNA1組細胞進行后續實驗，見圖2。

2.3CCK-8檢測細胞存活率 與Control組相比，Model組細胞存活率明顯下降(P<0.05)，與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細胞存活率明顯提高(P<0.05)，見圖3。

圖1 紅色熒光標記的siRNA檢測Apaf-1轉染效率(×200)Fig.1 Detection of transfection efficiency of Apaf-1 by siRNA labeled with red fluorescence(×200)

圖2 Western blot檢測各組Apaf-1轉染效率Fig.2 Western blot detected Apaf-1 transfection efficiency in each groupNote:*.P<0.05 vs NC-siRNA；#.P<0.05 vs siRNA2 and siRNA3.

圖3 CCK-8檢測各組PC12細胞存活率Fig.3 CCK-8 detection of PC12 cell survival rate in each groupNote:*.P<0.05 vs Control；#.P<0.05 vs Model.

圖4 TUNEL染色檢測各組PC12細胞凋亡指數

圖5 流式細胞術檢測各組PC12細胞凋亡率Fig.5 Flow cytometry to detect apoptosis rate of PC12 cells in each groupNote:*.P<0.05 vs Control；#.P<0.05 vs Model.

2.4TUNEL染色檢測細胞凋亡指數 與Control組相比，Model組細胞凋亡指數明顯升高(P<0.05)，與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細胞凋亡指數明顯降低(P<0.05)，見圖4。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 與Control組相比，Model組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖5。

2.6免疫熒光檢測細胞Bax/Bcl-2比值 與Control組相比，Model組細胞Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，Apaf-1-siRNA組細胞Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05)，見圖6。

2.7Western blot檢測細胞Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達 與Control組相比，Model組線粒體凋亡通路關鍵蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達明顯升高

圖6 免疫熒光檢測各組PC12細胞Bax/Bcl-2比值

圖7 Western blot檢測各組PC12細胞Apaf-1、caspase-9、caspase-3蛋白表達Fig.7 Western blot to detect of Apaf-1，caspase-9 and caspase-3 protein expression in PC12 cellsNote:*.P<0.05 vs Control；#.P<0.05 vs Model.

3 討論

線粒體凋亡通路中最重要的是caspase途徑，在細胞凋亡過程中發揮重要作用[7-8]。其發生過程主要是線粒體釋放CytC、AIF、核酸內切酶G等凋亡誘導因子，其中CytC與細胞質中的Apaf-1結合，促使Apaf-1寡聚化，形成CytC-Apaf-1-caspase-9復合物，即凋亡小體，最終導致細胞凋亡。Apaf-1作為連接上下游調控因子的中間蛋白，在凋亡啟動過程中發揮關鍵作用[9-10]。caspase-9通過改變分子構象而自我激活，被切割，激活效應caspase，如caspase-3和caspase-7，導致廣泛的蛋白質分解和細胞凋亡[11-12]。研究發現，在細胞凋亡發展過程中，盡管凋亡因子被激活，但仍在一定程度上處于受控狀態，Apaf-1作為調控因素，其表達水平是線粒體凋亡通路的限制因素之一[13]。以Apaf-1為中心的凋亡小體形成是凋亡發展過程中的關鍵事件，可激活下游caspase級聯反應。低水平的Apaf-1蛋白在線粒體凋亡誘導因子緩慢釋放的條件下，可能被認為是一種調節屏障，使細胞避免凋亡[14]。

VAIBHAV等[15]采用大鼠大腦中動脈閉塞模型在大鼠體內模擬腦缺血再灌注損傷環境，探討Apaf-1在腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體凋亡通路中的作用，結果發現，模型組大鼠腦組織明顯梗死，線粒體通路關鍵凋亡蛋白Apaf-1表達上調，caspase-3和caspase-9活性明顯增強，藥物干預抑制Apaf-1表達可顯著降低激活的caspase-3和caspase-9水平，明顯減小腦梗死體積，減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能障礙，表明Apaf-1介導的線粒體凋亡通路在調控大鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡過程中發揮重要作用。Apaf-1不僅在哺乳動物細胞線粒體凋亡通路中發揮引擎作用，在昆蟲體內Apaf-1同樣具有重要作用。晏琳等[16]通過靶向沉默斜紋夜蛾細胞中一種新的Apaf-1(S1-Apaf-1)觀察S1-Apaf-1對線粒體凋亡通路的影響，結果發現下調S1-Apaf-1蛋白表達可顯著降低細胞凋亡率，證實Apaf-1在調控線粒體凋亡通路中扮演關鍵角色。

課題組前期研究發現，PC12細胞經氧糖剝奪/復氧復糖處理后，凋亡蛋白CytC、caspase-3、caspase-9表達均明顯上調，細胞凋亡率明顯升高，其作用機制可能與激活線粒體凋亡通路相關。但Apaf-1作為線粒體凋亡通路中的關鍵調節蛋白，其在氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞線粒體凋亡通路中的具體作用尚未明確。因此，本研究在前期研究基礎上，通過基因沉默靶向抑制Apaf-1表達，探討Apaf-1對氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞線粒體凋亡通路的影響，結果發現，沉默Apaf-1基因后，線粒體凋亡通路關鍵蛋白Apaf-1、caspase-9、caspase-3表達明顯下調，Bax/Bcl-2比值降低，細胞凋亡指數和凋亡率明顯降低，細胞存活率明顯升高。表明靶向抑制Apaf-1表達可有效抑制氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞線粒體凋亡通路相關蛋白表達，減輕細胞凋亡，提高細胞存活率，發揮保護作用。本研究通過基因沉默靶向抑制Apaf-1表達，精準調控線粒體凋亡通路，在細胞水平探討了Apaf-1對腦缺血再灌注線粒體凋亡通路的影響，為腦缺血再灌注損傷的靶向治療提供了新的思路。