尿毒康合劑對缺血再灌注損傷大鼠的腎保護作用及其機制研究

安海文，李 李，李燕林，劉琳娜，黃 琳，李錦山，楊文欽

0 引言

急性腎損傷或衰竭的發生多由于腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)引起，此外，腎移植期間或腹主動脈手術而導致的RIRI亦是多器官衰竭的誘發因素。RIRI的特征是急性腎功能惡化和腎臟炎癥，最終導致組織損傷[1]。RIRI的病理生理學很復雜，其特征在于3個組成部分：中性粒細胞浸潤，活性氧形成和先天免疫激活，其中關于RIRI中的先天免疫激活，已經確定了補體激活的關鍵作用，盡管補體抑制被認為是潛在的治療策略，然而目前仍然沒有確切的用于RIRI的療法[2]。目前普遍認可的RIRI防治原則是調控炎癥因子，減少細胞的凋亡，使缺血組織的代謝及損傷得到改善，防止鈣超載，調控再灌注條件，使自由基得到清除[3-4]，因此，相關的研究多從上述方面入手。

尿毒康合劑是我院自主研發的制劑，主要成分為黃芪、紅花、丹參、澤瀉、大黃等中藥，具有清熱解毒、益氣生血、化瘀等功效。為我院治療慢性腎功能衰竭的常用制劑，長期臨床研究表明，尿毒康合劑可改善腹膜透析患者的殘余腎功能，亦能提高腹膜透析患者的透析效能，延緩腎功能惡化，具有抑制腹膜纖維化和腎臟微炎癥的作用[5-7]。目前隨訪的服用尿毒康合劑的患者中未發現相關的嚴重副作用。此外，前期研究發現，尿毒康合劑可能通過降低TGF-β1蛋白的表達和減輕相應的氧化應激作用，防止腹膜致密層變厚及其相應間皮細胞發生損傷[8];此外，該制劑亦可使慢性腎功能衰竭大鼠BUN、Scr水平得到控制，減輕靶器官的損傷，提高排毒能力及免疫力[9-10]。銀杏葉提取物藥理作用主要有抗氧化及血小板聚集、清除自由基、改善血液流變學等，亦可保護再灌注后的器官組織[11]。參考相關研究報道[12]，本課題組經由外科手術建立SD大鼠RIRI的模型，以銀杏葉提取物作為陽性藥，考察尿毒康合劑對改善腎功能的作用及其機制，以期為藥物的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 73只SPF級的體重210～230 g(7～9周齡)的雄性健康的SD大鼠，購于山東省實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(魯)20140007，SD大鼠于中山市中醫院藥理室SPF動物房飼養[使用許可證號SYXK(粵)2015-0109]，SD大鼠飼料與墊料均購自廣州市實驗動物中心[飼養條件：控制適宜的溫濕度，溫度控制在(23±3)℃，濕度控制在(55%±15%)，每12 h進行明暗交替]，提供適量清潔的飲用水和飼料，先進行3 d適應性的飼養，然后開始正式實驗。

1.1.2 藥品與試劑 尿毒康合劑(中山市中醫院制劑室研制，批號：20180102，規格：100 ml/瓶);銀杏葉提取物(江蘇金納多生物科技有限公司，批號：20171213);大鼠IL-6、IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，批號：190238672、H3567914、S51384664，規格：96T);水合氯醛(西隴科學試劑有限公司，批號：20180465，AR);FAS/FASL單克隆抗體(一抗)(ThermoFisher，批號：SMFIO-PC2341);甲醛(天津市大茂化學試劑有限公司，批號：20180606，AR);二甲苯(衡陽市凱信化工試劑有限公司，批號：20180712);DAB試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司，批號：PT2397);TUNEL試劑盒(上海如吉生物科技發展有限公司，批號：S9876);Cocktail(Sigma，批號：P2348);磷酸酶抑制劑[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號：THG382];BCA法檢測蛋白定量試劑盒(上海士鋒生物科技有限公司，批號：JKHG564);PageRuler Prestained Protein Ladder(Thermo，批號：65496);甲醇(SPECTRUM,批號：3GI21245)、30%丙烯酰胺(衡陽市凱信化工試劑有限公司，批號：21015556);蛋白預染Marker(北京卓悅聯合生物科技有限公司，批號：KL89664);一抗稀釋液及RIPA裂解液(上海信裕生物科技有限公司，批號：GK1167);中性樹膠、30%過氧化氫、過硫酸銨、Tris Base、Skimmed milk powder、Glycine、SDS、亞硫酸鈉、β-巰基乙醇、冰乙酸、glycerin、酒精、4%多聚甲醛、硫代硫酸鈉、磷酸緩沖鹽溶液及枸櫞酸緩沖液、Tween-20(天津大茂化學試劑);BPB(博大泰克);1%伊紅染液、顯影粉、石蠟、10%正常山羊血清、蘇木素染液及其分化液。

1.1.3 儀器 PL-25G-I離心機(Anting科學儀器廠);Muitiskan MLB3酶標儀(熱電科技有限公司);SK961洗板機(深圳市盛信康科技有限公司);Varioskan LUX全自動生化分析儀(賽默飛世爾);XP205DR分析天平(梅特勒);OGH180-S烘箱(賽默飛世爾);MaxQ2000臺式搖床(賽默飛世爾);FR4A熒光顯微鏡(北京世紀科信科學儀器有限公司);DYCZ-40G型轉印電泳儀(上海向帆儀器有限公司);RT-I暗室燈及暗匣(天津銘齊科技有限公司)。

1.2 分組、給藥與建模 73只SD大鼠隨機分為6組：模型組、尿毒康合劑(低劑量4.95 g/kg、中劑量9.9 g/kg、高劑量19.8 g/kg)組，假手術組、100 mg/kg銀杏葉提取物組(陽性藥組)[12]，每組12只(模型組13只)。其中尿毒康合劑中劑量治療組給藥量相當于人臨床等效劑量。取生理鹽水配制得到高劑量(9.9 g/ml)的尿毒康合劑適量，分別再將其稀釋2倍和4倍，得到中、低劑量的尿毒康合劑。陽性藥及各個劑量組的尿毒康合劑均給予2 ml的藥量來灌胃，其余組給予2 ml生理鹽水代替，每組都持續給藥7 d，1次/d。7 d以后，除假手術組外，另外5組大鼠均手術建立RIRI模型，各組大鼠手術前禁食12 h，飲水自由。實驗步驟如下：取10%的水合氯醛將各組的SD大鼠通過腹腔注射進行麻醉(3.5 ml/kg)，發揮藥效后，層層解剖，將腹腔中的腎蒂左右兩側用無損傷微型動脈夾快速阻斷，腎臟逐漸由鮮紅轉變成暗紫色時開始計時，45 min后將動脈夾撤掉，腎臟的顏色又恢復正常，此時提示造模成功，最后將腹腔縫合。假手術組的大鼠除了不進行阻斷腎蒂血流的操作外，其余手術操作同其他組的大鼠。注意保證關閉腹腔后2 h內，大鼠能正常活動，且術后24 h大鼠能存活，調整適宜的環境并給予食物和飲水保證其充分的休養[13-14]。

1.3 血液生化指標檢測[15-16]各組大鼠建模手術后24 h進行腹主動脈采血，用全自動生化分析儀分析血清中尿素氮值(BUN)及肌酐值(Scr)。應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及干擾素-γ(IFN-γ)3個炎癥指標。

1.4 石蠟切片處理[17-19]采血后取出大鼠的2個腎臟，其中1個用4%多聚甲醛對其部分組織進行固定，再用不同比例的乙醇、純化水及磷酸鹽緩沖溶液沖洗，最后用石蠟將切取的約0.2 cm厚的組織包埋，二甲苯脫蠟后沖洗，再用枸櫞酸buffer(pH值為0)煮沸，放冷后沖洗干凈。

1.5 腎小管上皮細胞凋亡率的檢測 按照TUNEL試劑盒說明書的方法處理上述石蠟切片，再用熒光顯微鏡(400×)觀察拍照，在熒光顯微鏡下可見未凋亡的細胞發出藍色熒光，凋亡的細胞發出綠色熒光，隨機分析計算腎小管上皮細胞凋亡率(細胞凋亡率=凋亡細胞數÷總細胞數×100%)[20-21]。

1.6 腎組織FAS、FASL蛋白的表達檢測 將以上石蠟切片用10%正常山羊血清封閉30 min，在4 ℃條件下，一抗孵育12 h，用buffer沖洗后將二抗及鏈霉素卵白素工作液依次加入，轉至37 ℃環境繼續孵育30 min，用buffer沖洗后經過DAB/H2O2反應，最后用蘇木素染色再脫水封片。用顯微鏡觀察記錄上述處理的切片，分析計算放大200倍與400倍時的積分光密度值(IOD/area)并繪制統計圖比較分析[17-19]。

1.7 細胞凋亡相關蛋白的表達檢測(Western blot法) 將上述取出的另一個腎臟的部分組織置于冰上，加適量蛋白質裂解液反應30 min，再低溫離心5 min(13 500 r/min)，分離出上清液，參照試劑盒說明書采用BCA方法進行定量分析。通過SDS-PAGE電泳對上述分離得到的蛋白進行分析，再將轉模后得到的雜交膜用TBST沖洗，并于室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h。最后一抗孵育過夜并漂洗后，在37 ℃條件下用二抗孵育1 h，TBST漂洗2遍即得雜交膜，將帶有熒光的化學底物添加其中于暗盒中顯影。以GAPDH為內參，考察目標蛋白的相對表達[14,22]。

2 結果

2.1 血液生化指標檢測結果 由表1及表2可知，與假手術組大鼠對比，模型組大鼠血清中的Scr、BUN、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平明顯上升，且差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組大鼠比，尿毒康合劑低、中、高劑量組及銀杏提取物組大鼠血清中的上述各指標均有下降趨勢，且差異均具有統計學意義(P<0.05)。此外，從相對模型組的下降程度來看，尿毒康合劑高劑量組的幾個指標相對模型組下降幅度均較中、低劑量組大，部分指標下降幅度甚至超過陽性藥。

表1 各組大鼠血清中Scr、BUN水平比較

2.2 腎小管上皮細胞凋亡率對比 用TUNEL法檢測的結果見表3。結果顯示，模型組大鼠與假手術組大鼠相比，腎小管上皮細胞凋亡率明顯上升(P<0.01)，此外，尿毒康合劑低、中、高劑量組大鼠與模型組大鼠相比細胞凋亡率均有所下降，且差異均具有統計學意義(P<0.05)，并呈現劑量依賴型趨勢，隨著尿毒康合劑劑量的提高凋亡率也隨著下降，尿毒康合劑高劑量組抑制細胞凋亡的效果優于陽性藥組。見圖1、表3。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較

圖1 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡結果比較(400×)

表3 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率比較

2.3 各組大鼠FAS、FASL蛋白表達水平比較 圖2為各組大鼠腎組織石蠟切片在放大200倍與400倍視野下測得的FAS和FASL蛋白表達量。模型組大鼠相對于假手術組兩種蛋白的表達量均明顯升高，且差異均具有統計學意義(P<0.05)。此外，相對于模型組大鼠，隨著尿毒康合劑劑量的提高，上述蛋白表達量也相應降低，其程度亦具有劑量依賴性，劑量越大降低的趨勢就越明顯。

2.4 Western blot法檢測腎小管上皮細胞凋亡相關蛋白的表達水平 圖3、表4顯示，模型組大鼠相對于假手術組，Bcl-2和VEGF蛋白的表達量較低，其余腎小管上皮細胞凋亡相關蛋白的表達均較高，且差異均具有統計學意義(P<0.05)。而尿毒康合劑各劑量組相比，模型組大鼠Bcl-2和VEGF蛋白的表達量較高，其余腎小管上皮細胞凋亡相關蛋白的表達均較低。尿毒康合劑各劑量組的大鼠7種蛋白的表達均有劑量依賴性的變化趨勢，其中Bcl-2和VEGF蛋白的表達量隨著給藥劑量的增加而增加，其余5種蛋白則反之。

圖2 各組大鼠腎組織石蠟切片在200×與400×下測得的FAS和FASL蛋白表達量比較注：與假手術組比較，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05

表4 各組大鼠腎組織Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bad和VEGF蛋白相對表達量比較

圖3 各組大鼠腎組織Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bad和VEGF蛋白表達電泳圖

3 討論

本課題組前期報道了尿毒康合劑的質量標準[23]，因此，上述研究的樣品質量具有可重復性，從而保證了實驗結果的可重復性。

RIRI可致腎功能廣泛性損傷，從而致使腎小球的通透性增強而濾過率下降，腎小管上皮細胞受損致重吸收作用減弱，而Scr、BUN升高常預示上述病理現象，因此二者常作為評價腎功能的生化指標。結合本實驗結果可知，尿毒康合劑對降低Scr和BUN指標有一定作用，故而一定程度上尿毒康合劑可改善腎功能。

炎癥過程始于腎小管上皮損傷，使得腎小管上皮細胞功能障礙及IL-6、TNF-α、IFN-γ等免疫調節因子被釋放到血液循環及腎組織中，進而使血管黏附分子表達增加及白細胞之間黏附作用增強。此外，有研究表明，炎癥反應在RIRI過程中起重要作用，而IL-6、TNF-α及IFN-γ可間接反映炎癥反應的程度[16,24]。本研究結果表明，尿毒康合劑可能通過降低炎癥因子水平來減輕炎癥反應對組織器官的損傷。

由各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率比較可知，尿毒康合劑劑量越大，對細胞凋亡的抑制作用越強，因此，可通過細胞凋亡相關蛋白的表達水平來評價藥效。細胞表面受體蛋白FAS通過與其配體FASL結合來激活細胞凋亡信號通路，進而促使細胞凋亡[25]，因此，可通過抑制FAS和FASL來抑制細胞凋亡。Bax及Bad均為常見的促細胞凋亡蛋白，而Bcl-2為抑制細胞凋亡蛋白，Bax與Bcl-2二者高度相關，其比例大小可影響腎小管上皮細胞凋亡[26]。VEGF蛋白為促使內皮細胞增殖的有絲分裂原，具有調控血管通透性及改善新生血管等作用，因此，VEGF蛋白的高表達可促進腎功能的恢復[27]。線粒體及死亡受體兩個途徑介導的細胞凋亡都有Caspase 家族相關蛋白參與，其中Caspase-3為凋亡執行因子，Caspase-8及Caspase-9均為Caspase-3執行細胞凋亡的輔助因子，三者的綜合作用可促進細胞凋亡[28]。綜上所述，Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9這5種蛋白高表達可促進細胞凋亡，而Bcl-2與VEGF蛋白分別具有抑制細胞凋亡與促進細胞增殖的功能。結合實驗結果可知，尿毒康合劑可通過降低促細胞凋亡蛋白的表達，增加抑制細胞凋亡蛋白和促細胞增殖蛋白的表達來減輕腎小管上皮細胞凋亡所帶來的損傷。