HPLC-QAMS法同時測定前列平膠囊中7種成分的含量

劉德軍，賀 玲，樊苗苗，陶弘武，慕揚娜

0 引言

前列平膠囊主要由北敗醬、紅花、丹參、赤芍、桃仁、澤蘭、石韋、乳香和沒藥9味中藥組方而成，臨床上主要用于濕熱瘀阻所致的急、慢性前列腺炎的治療[1-4]。前列平膠囊方中北敗醬清熱解毒、祛瘀止痛，為君藥;紅花、桃仁活血祛瘀、潤腸止痛，赤芍清熱涼血，為其臣藥;丹參活血祛瘀、涼血消癰，乳香、沒藥散瘀定痛、消腫生肌，澤蘭祛瘀消癰、利水消腫，合為佐藥;石韋利尿通淋、涼血止血，引諸藥直達病所，為使藥，諸藥合奏，以達清熱利濕、化瘀止痛的臨床功效。前列平膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標準和文獻報道[5]中僅對芍藥苷、丹酚酸B進行了定量研究,未對方中君藥北敗醬及其他藥味所含成分進行研究。中藥及其制劑具有多組分、多靶點、整體協(xié)同作用的特點，近年來，多指標成分質(zhì)量評價模式已廣泛應用于其質(zhì)量控制中。本研究按照中藥質(zhì)量標志物確認原則，采用HPLC-QAMS法對前列平膠囊方中君藥北敗醬所含代表性成分菊苣酸，臣藥紅花所含特征成分羥基紅花黃色素A和紅花黃色素A，佐藥丹參所含主要活性成分丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量進行同時測定，為全面評價前列平膠囊質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)、Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司);Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);XS105DU型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。菊苣酸對照品(批號：111752-201703，CAS號：6537-80-0，含量：97.6%)、羥基紅花黃色素A對照品(批號：111637-201810，CAS號：78281-02-4，含量：93.1%)、丹酚酸B對照品(批號：111562-201917，CAS號：121521-90-2，含量：96.6%)、丹參素鈉對照品(批號：110855-201915，CAS號：67920-52-9，含量：97.8%)和丹參酮ⅡA對照品(批號：110766-201721，CAS號：568-72-9，含量：99.5%)均來源于中國食品藥品檢定研究院;丹參酮Ⅰ對照品(批號：17051706，CAS號：568-73-0，含量：99.9%)來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司;紅花黃色素A對照品(批號：CFS201801，CAS號：85532-77-0，含量：98.5%)來源于武漢天植生物技術(shù)有限公司;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純;前列平膠囊[規(guī)格：每粒裝0.42 g(相當于飲片2.2 g)，批號：20190207、20190402、20190403]來源于西安千禾藥業(yè)有限責任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 單組分對照品儲備液和混合對照品溶液的制備 精密稱取菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、丹參酮 Ⅰ 和丹參酮 Ⅱ A對照品各適量，用70%甲醇溶液分別制成菊苣酸0.132 mg/ml、羥基紅花黃色素A 0.918 mg/ml、紅花黃色素A 0.774 mg/ml、丹參素0.162 mg/ml、丹酚酸B 2.526 mg/ml、丹參酮Ⅰ 0.218 mg/ml、丹參酮Ⅱ A 0.356 mg/ml的單組分對照品儲備液;精密吸取單組分對照品儲備液各2.5 ml，用70%甲醇溶液定容至50 ml，制成各成分質(zhì)量濃度分別為6.6、45.9、38.7、8.1、126.3、10.9和17.8 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備 取前列平膠囊10粒內(nèi)容物，研細混勻，精密稱取0.5 g，置25 ml量瓶中，加70%甲醇20 ml，超聲處理30 min，放冷后用70%甲醇定容至刻度，過濾制得前列平膠囊供試品溶液。按前列平膠囊質(zhì)量標準WS-10459(ZD-0459)-2012Z-2018項下的工藝處方，分別制備不含北敗醬、紅花和丹參的3個陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件及專屬性試驗 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃;流動相：乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～11.0 min，14.0%A;11.0～15.0 min，14.0%A→22.0%A;15.0～24.0 min，22.0%A→30.0%A;24.0～45.0 min，30.0%A→72.0%A;45.0～50.0 min，72.0%A→14.0%A)，流速為1.0 ml/min;檢測波長分別為330 nm(0～15.0 min檢測菊苣酸)[6]、403 nm(15.0～24.0 min檢測羥基紅花黃色素A和紅花黃色素A)[7]和280 nm(24.0～50.0 min檢測丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA)[8-10];進樣量：10 μl。精密吸取“2.1～2.2”項下各溶液依法進樣檢測，結(jié)果主成分菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素鈉、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA色譜峰峰形對稱，理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計均不低于4 000，主成分峰與相鄰色譜峰均能有效分離，分離度均>1.5，陰性樣品對前列平膠囊中7種成分的測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗HPLC圖注：a.混合對照品，b.前列平膠囊，c.北敗醬陰性樣品，d.紅花陰性樣品，e.丹參陰性樣品。1.菊苣酸，2.羥基紅花黃色素A， 3.紅花黃色素A，4.丹參素，5.丹酚酸B，6.丹參酮 Ⅰ，7.丹參酮 ⅡA

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項下單組分對照品儲備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，置20 ml量瓶中，用70%甲醇溶液制成系列混合對照品溶液，依法進樣測定菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮 ⅡA的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7個成分線性關(guān)系和范圍

2.5 進樣精密度、重復性及穩(wěn)定性考察 取“2.1”項下混合對照品溶液重復進樣6次，測得菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA色譜峰峰面積的RSD分別為1.35%、0.89%、1.01%、1.26%、0.58%、1.11%和0.97%。

取同一批號前列平膠囊樣品，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，依法進樣測定菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，計算得7種成分含量的RSD分別為0.81%、1.34%、1.40%、1.72%、0.96%、1.58%和1.63%。

取前列平膠囊同一份供試品溶液，于制備后0、2、4、6、12、18 h、24 h進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，結(jié)果前列平膠囊供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，7種成分峰面積的RSD分別為1.33%、0.91%、0.99%、1.25%、0.57%、1.08%和0.95%。

2.6 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次前列平膠囊內(nèi)容物，研細混勻，取9份，每份0.25 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，按《中國藥典》2015年版四部要求，分別按已知含有量的50%、100%、150% 3個水平精密加入加標對照品溶液(菊苣酸0.074 mg/ml、羥基紅花黃色素A 0.626 mg/ml、紅花黃色素A 0.422 mg/ml、丹參素0.114 mg/ml、丹酚酸B 1.818 mg/ml、丹參酮Ⅰ 0.146 mg/ml、丹參酮ⅡA 0.238 mg/ml)0.5、1.0、1.5 ml各3份，再按“2.2”項下方法制備加樣品溶液。

在上述色譜條件下進行檢測，結(jié)果所測成分菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的平均加樣回收率及RSD分別為97.86%(1.44%)、99.42%(0.96%)、99.18%(0.83%)、96.97%(1.11%)、100.02%(0.59%)、97.91%(1.37%)和98.90%(0.76%)。

2.7 相對校正因子的測定及耐用性考察

2.7.1 相對校正因子的測定 精密吸取“2.4”項下6個混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，以丹酚酸B為內(nèi)參物，按照相對校正因子計算公式：fk/s=fk/fs=(Xk×Ys)/(Xs×Yk)(式中X代表質(zhì)量濃度，Y代表峰面積，k代表內(nèi)參物，s代表其他成分)計算菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 各成分的相對校正因子

2.7.2 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，考察Shimadzu LC-20A型、Agilent 1200型高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響

2.7.3 不同柱溫對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，考察不同柱溫28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.7.4 不同體積流量對相對校正因子的影響 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，考察不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 ml/min)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同體積流量對相對校正因子的影響

2.8 待測組分色譜峰的定位 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液，依法進樣檢測，記錄菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的保留時間，采用相對保留時間值法對待測成分色譜峰進行定位，考察Shimadzu LC-20A型、Agilent 1200型高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對相對保留時間值的影響，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器和不同色譜柱待測成分色譜峰的相對保留值

2.9 一測多評法與外標法測定結(jié)果比較 取3個批次的前列平膠囊樣品，每個批次平行制備3份前列平膠囊供試品溶液，依法進樣測定菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的峰面積，首先采用外標法(ESM)計算7種成分的含量，再以丹酚酸B為內(nèi)參物，按照“2.7.1”項下相對校正因子計算菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量，結(jié)果見表7。結(jié)果顯示一測多評法計算值與外標法實測值無明顯差異(RAD<2.0%)，表明所建立的相對校正因子可信度較高，所建立的一測多評法可用于前列平膠囊中菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量的同時測定。

表7 各成分含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定 萃取溶劑的選擇，首先采用甲醇[11]、70%甲醇[10-11]、70%乙醇[12]、95%乙醇處理樣品，以前列平膠囊中菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的提取效果為首選指標，同時兼顧雜質(zhì)峰影響等因素，結(jié)果70%甲醇處理樣品時，待測成分綜合提取率最佳，雜質(zhì)峰干擾較小;提取方式的選擇，對超聲提取[6-7,9-10]和回流提取2種提取方式進行對比，結(jié)果超聲提取、回流提取所得結(jié)果差異不大，考慮到樣品處理的便捷性，選用超聲提取處理樣品;提取時間的選擇，經(jīng)試驗，確定超聲提取30 min效果最佳。

3.2 色譜條件流動相的選擇 對甲醇-水[6,11-12]和乙腈-水[7-9]流動相系統(tǒng)進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲醇-水流動相體系檢測時，基線漂移嚴重，同時檢測時間過長;乙腈-水流動相體系檢測基線平穩(wěn)，檢測用時理想，不足之處是丹酚酸B因含量高，色譜峰出現(xiàn)平頭峰和拖尾現(xiàn)象，峰形對稱度不符合要求，考慮加入酸類調(diào)節(jié)。經(jīng)試驗，最終確定采用乙腈-0.4%磷酸水溶液[7,9-10]為流動相進行梯度洗脫，前列平膠囊中待測7種成分的色譜峰峰形對稱，與相鄰色譜峰均能有效分離。

本文首次采用HPLC-QAMS法對前列平膠囊中菊苣酸、羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 7種成分的含量進行了同時測定，建立了前列平膠囊多指標成分同時定量的方法，所建立的方法操作便捷，結(jié)果準確可靠，對前列平膠囊質(zhì)量標準提升和全面評價其產(chǎn)品質(zhì)量，指導藥品生產(chǎn)企業(yè)優(yōu)化生產(chǎn)工藝過程控制參數(shù)，完善原藥材內(nèi)控標準，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性提供了參考依據(jù)。采用高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合多成分質(zhì)量控制對前列平膠囊進行更加全面的質(zhì)量評價還在進一步的研究中。