欖香烯乳對小鼠全腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

趙麗英，鄭 蓓（.德清縣人民醫院臨床藥學室，浙江 湖州 3300；.浙江省立同德醫院臨床藥學室，浙江 杭州 300）

缺血性腦血管病是臨床常見病、多發病，致殘致死率極高[1]，因此研發新型抗腦缺血性藥物具有重要的臨床意義。欖香烯是從姜科植物莪術的揮發油中提取出來的抗癌有效成分，具有行氣破血的功效，目前欖香烯已在臨床上應用并取得較好療效[2]，但其機制尚未闡明。研究[3]表明在大鼠腦缺血模型中，欖香烯乳可降低腦內炎癥因子水平并具有一定的腦損傷保護作用。腦缺血/再灌注損傷是多種機制參與的一種復雜病理生理過程，主要與自由基過度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細胞內鈣超載、炎性反應等多種機制有關，這些因素互為因果，最終導致神經元損傷[4]。本研究采用小鼠全腦缺血模型，研究欖香烯乳對其神經保護作用及相關機制，以期為缺血性腦血管病的病理機制及治療方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠，雄性，體質量22～25 g，購自浙江省醫學科學院動物中心，動物合格證號：SCXK（浙）2014-0001。動物實驗在浙江省醫學科學院動物中心屏障環境完成，動物使用許可證：SYXK（浙）2014-0008。小鼠均可自由進食、飲水；室溫控制在（22±3）℃，日溫差≤ 3 ℃，相對濕度40%～70%。18只小鼠隨機分為假手術組、模型組和欖香烯乳組，每組6只。欖香烯乳組分別于術前和術后30 min腹腔注射欖香烯乳10 mg·kg-1，欖香烯乳用生理鹽水稀釋，每只小鼠注射0.2 mL；假手術組和模型組注射等體積的生理鹽水。

1.2 主要試劑與儀器

欖香烯乳注射液購自大連金港制藥有限公司（規格0.1 g∶20 mL）；蘇木素-伊紅染色（HE）試劑由浙江省醫學科學院實驗室配置；4%多聚甲醛（上海酶聯生物科技有限公司，批號：190203）；TUNEL試劑盒（美國Roche公司）；IL-1βELISA試劑盒，IL-6 ELISA試劑盒和TNF-αELISA試劑盒（加拿大Anogen公司）；多功能酶標儀（型號：Enpire，美國Perkin Elmer公司），顯微鏡（型號：BX51，日本Olympus公司）。

1.3 全腦缺血再灌注模型的制備

小鼠于術前12 h禁食不禁水，用10%水合氯醛（400 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，頸正中切口剪開筋膜，暴露雙側頸總動脈，用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈，夾閉10 min后松開動脈夾，恢復腦部供血，縫合切口，術后置于溫床觀察，提供充足食物和水。術中動物死亡3只，死亡率為20%。假手術組除不夾閉頸總動脈外，其余操作同模型組。術后小鼠進行神經癥狀評分，1～4分為有效模型。

1.4 神經癥狀和神經功能評分

術后24 h觀察各組動物的神經癥狀和功能，參照文獻中的方法[5]。神經癥狀評分等級分五級：0分為無癥狀，1分為背部弓起，2分為強直性癲癇發作，3分為上瞼下垂，4分為無意識。神經功能評分：1）平衡木測試：將小鼠置于直徑為2.0 cm的平衡木上，小鼠保持的時間至少30 s記為3分；2）抓握牽引測試：小鼠置于直徑為1.0 cm的懸空尼龍繩上，在繩上停留的時間至少5 s記為3分；3）網格測試：將小鼠置于一個面積為20 cm×40 cm的網格板上，平板快速從水平轉為垂直過程中小鼠在網格的停留時間至少15 s記為3分。將三項測試記分之和作為小鼠的神經功能評分。

1.5 組織樣本制備

小鼠行為學評分后，摘取眼球采血方式致死。分離血清，分裝凍存于- 80 ℃冰箱，用于測定炎癥因子的含量。小鼠取血后快速斷頭取腦，用4%多聚甲醛緩沖液室溫固定48 h，用于組織病理學檢查及免疫組化實驗。

1.6 腦組織病理組織學檢查

多聚甲醛固定后的腦組織經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、烤箱內浸蠟，石蠟包埋處理后，在AO切片機上連續切片，厚度為10 μm，每間隔5片取1片用于實驗。切片浸潤30%乙醇后放入水浴箱中展平，粘貼于載玻片上，常規HE染色、封片，光鏡下觀察、拍照，并計算神經元密度。

1.7 TUNEL染色檢測神經元凋亡

樣本石蠟切片后，按TUNEL試劑盒說明書進行操作，將切片置于光鏡下觀察并拍照，若細胞核染為棕黃色即為TUNEL陽性細胞，統計TUNEL陽性細胞數，計算神經元凋亡率（%）=（TUNEL陽性細胞數/假手術組平均TUNEL陽性細胞數）×100。

1.8 ELISA法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α濃度

將各組收集好的血清置于冰上凍融，用于檢測IL-1β、IL-6和TNF-α濃度，操作方法參照ELISA試劑盒說明書執行，在450 nm處測定樣本吸光度。

1.9 統計學方法

采用GraphPad Prism軟件進行數據統計分析，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠神經癥狀和神經功能評分

假手術組術后24 h無明顯神經癥狀；與假手術組比較，模型組神經癥狀評分明顯增高（P＜ 0.001），83.33%小鼠發生癲癇，部分伴有上瞼下垂；而欖香烯乳組與模型組相比，術后24 h神經癥狀評分明顯降低（P＜ 0.05），見表1。與假手術組比較，模型組術后24 h神經功能評分較高（P＜ 0.001），欖香烯乳組神經功能評分較模型組有明顯改善（P＜ 0.001），見表1。結果提示，欖香烯乳可在一定程度上改善小鼠全腦缺血模型神經功能障礙。

表1 各組小鼠神經癥狀和神經功能評分Tab 1 Neurological symptoms and neurological function scores of mice in each group

2.2 小鼠腦組織病理結構改變

HE染色結果表明，假手術組無明顯神經元細胞損傷；與假手術組相比，模型組神經元受損，核固縮明顯，著色加深，并且皮層神經元密度降低了56.9%（P＜0.001）；欖香烯乳組與模型組相比，神經元損傷，核固縮和神經元染色均明顯減輕，皮層神經元密度提高了31.1%（P＜ 0.001），見表2。結果提示，欖香烯乳可減輕小鼠全腦缺血再灌注誘導的大腦皮層神經元損傷。

2.3 小鼠大腦皮層神經元細胞凋亡情況

與假手術組比較，模型組大腦皮層TUNEL陽性細胞數明顯增多，凋亡率為267.6% （P＜ 0.001）；與模型組比較，欖香烯乳組明顯減少皮層TUNEL陽性細胞數（P＜ 0.001），減少了110.8%，見表3。結果提示，欖香烯乳可減少小鼠全腦缺血再灌注損傷誘導的皮層神經元凋亡。

表3 各組小鼠大腦皮層神經元凋亡率Tab 3 Apoptotic percentage of cortical neuron in mice in each group

2.4 小鼠血清炎癥因子水平分布情況

與假手術組比較，模型組炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平均顯著增高（P＜ 0.001）；與模型組相比，欖香烯乳組顯著減少IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平（P＜ 0.001），分別減少了74.3%、48.0%和76.6%。表4結果提示，欖香烯乳可減輕小鼠全腦缺血再灌注損傷誘導的外周炎癥水平。

3 討論

缺血性腦血管病，包括全腦缺血，在臨床中較為常見。肺栓塞、溺水、心臟驟停、心肺手術和休克等引起的低血壓均可造成腦血流量低灌注和缺血性腦損傷。腦缺血發病率逐年增高，在臨床尚無有效的干預手段，因此針對腦缺血再灌注損傷的治療已成為當今腦血管病研究的一個熱點。欖香烯是從中藥莪術中提取的有效成分，它是我國自主開發研制的廣譜抗癌二類新藥，具有降低腫瘤細胞有絲分裂能力，誘發腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長[6]。研究[3,7]表明，欖香烯可透過血腦屏障，降低大鼠腦缺血側紋狀體內炎癥因子水平，對腦缺血再灌注損傷具有改善作用。本研究采用夾閉小鼠雙側頸總動脈的方法制作全腦缺血再灌注模型，并通過神經癥狀和神經功能評分證實模型制作成功。從形態學上可以發現，模型組小鼠大腦皮層神經元細胞有明顯損傷。本研究發現欖香烯乳對小鼠全腦缺血損傷具有一定的保護作用，可減輕術后24 h小鼠神經功能障礙和皮層神經元損傷。

表4 各組小鼠血清炎癥因子水平Tab 4 Serum levels of inflammatory cytokines of mice in each group

腦缺血再灌注損傷的發病機制十分復雜，目前尚不明確。已有研究表明其發病機制可能是神經細胞缺血缺氧，引起過度自噬及炎癥反應，而再灌注后加速細胞凋亡、誘發炎癥級聯反應[8-10]。炎癥反應啟動后，活化的神經細胞會產生和釋放促炎因子，包括TNF-α，IL-6等，從而導致腦缺血過程中神經元細胞的死亡。另外，促炎因子還可誘導黏附分子的表達，這些黏附分子會促進外周免疫細胞如中性粒細胞、單核巨噬細胞的滲透，這通常會導致二次神經元損傷，稱為缺血再灌注損傷[11-12]。因此抑制神經元凋亡和神經網絡炎癥反應是治療腦缺血再灌注損傷的有效手段。本研究發現全腦缺血再灌注損傷可增加皮層神經元凋亡數量，上調血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平，這與既往研究結果一致[13]，再次證實了凋亡和炎癥在腦缺血損傷中發揮著重要作用。欖香烯乳可減少小鼠大腦皮層神經元凋亡，降低外周炎癥因子的表達水平。本研究從整體動物水平證實欖香烯乳對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，并探索其機制涉及抗凋亡和抗炎作用。

綜上所述，欖香烯乳可通過減輕皮層神經元凋亡和炎癥水平而減輕小鼠全腦缺血再灌注損傷，但其抗凋亡、抗炎涉及的信號通路機制尚不清楚，有待進一步的研究加以闡明。