反相高效液相色譜法測定人血清中泊沙康唑的濃度

計建軍，張 慧，查 麗，費愛麗，王小琴，蔡繼明，徐少毅，王長江（.嘉興學院附屬第二醫院藥學部，浙江 嘉興 34000；.嘉興學院附屬第二醫院重癥醫學科，浙江 嘉興 34000）

泊沙康唑是新一代三唑類廣譜抗真菌藥物，抗真菌譜比氟康唑、伊曲康唑更廣，不良反應發生率比伏立康唑更低[1]。除了對曲霉菌和念珠菌有效外，對接合菌和毛霉菌也有作用[2-3]。泊沙康唑是親脂性藥物，口服劑型有緩釋片和混懸液兩種[4]，口服生物利用度變異大，在人體內呈非線性藥代動力學過程，不同人的血藥濃度差異大，提示臨床進行血藥濃度監測的必要性[5-6]。泊沙康唑是肝微粒體酶CYP3A4抑制劑，會與體內多種藥物產生相互作用，干擾彼此的代謝[7]。目前泊沙康唑的藥物濃度檢測方法有高效液相色譜法、高效液相-質譜/質譜聯用法等[8-9]。由于多數檢測方法繁瑣復雜，且儀器設備比較昂貴，檢測費用也相對較高，本研究通過改進文獻中的方法，建立一種簡便、快速、準確的泊沙康唑血藥濃度測定方法，為臨床個體化給藥提供依據，確保患者用藥安全。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），SC-2546臺式低速離心機（上海醫療器械有限公司），XW-80A旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠），W201B恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）。

1.2 試劑

泊沙康唑對照品（東京化成工業株式會社， 批號：P2477，液相用，純度98%），阿普唑侖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號171218-200603），甲醇、乙腈為色譜純（MERCK公司），重蒸水（自制）。

2 方法與結果

圖1 HPLC色譜圖A-空白血清，B-對照品血清，C-患者血清；1-阿普唑侖，2 -泊沙康唑Fig 1 HPLC chromatogramA-blank serum，B-reference serum，C-patient serum; 1 -alprazolam, 2-posaconazole

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18保護柱（4 mm×4 mm，5 μm），流動相為乙腈∶水 = 60∶40，檢測波長為262 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，進樣量20 μL。

2.2 對照品和內標溶液制備

精密稱取泊沙康唑對照品適量，用甲醇溶解并制成泊沙康唑100 μg·mL-1的標準品儲備液；精密稱取阿普唑侖對照品適量，用甲醇溶解并制成濃度為10 μg·mL-1的內標溶液，置4 ℃冰箱保存。

2.3 血清樣品預處理

取內標溶液50 μL，于50 ℃水浴中氮氣吹干，加入200 μL待測血清，加800 μL乙腈沉淀蛋白，漩渦混勻5 min，4000 r·min-1離心10 min，取上清液500 μL，于50 ℃水浴中氮氣吹干，用流動相100 μL溶解，取20 μL進樣。

2.4 方法專屬性

分別取空白血清，空白血清加入內標和泊沙康唑對照品溶液，患者血清按照“2.3”項下方法進行預處理，進樣得色譜圖，內標和泊沙康唑的保留時間分別為4.7 min和9.1 min，兩者分離良好，峰形對稱，且空白血清對內標和被測藥物均無干擾，檢測時間可以控制在10 min內，見圖1。

2.5 標準曲線的制備

分別取泊沙康唑對照品儲備液與空白血清配制成泊沙康唑濃度分別為50.000、10.000、5.000、2.500、1.000、0.500、0.125 μg·mL-1的對照品血清，按“2.3”項下方法處理后進樣。以對照品濃度（C）為縱坐標，對照品與內標的峰面積比值（A）為橫坐標，進行線性回歸，泊沙康唑的回歸方程為：C= 0.983 9 A + 0.403 9（r= 0.999 6），線性范圍為0.125～50.000 μg·mL-1。

2.6 相對回收率及精密度試驗

在同1 d內5個不同時間點與連續5 d相同的時間點，分別取低、中、高（1、5、25 μg·mL-1）三種濃度的泊沙康唑對照品血清，按“2.3”項下方法處理后進樣，計算方法回收率和日內、日間精密度，詳見表1。

表1 相對回收率和精密度Tab 1 Relative recovery and precision

2.7 絕對回收率試驗

分別取低、中、高3種泊沙康唑對照品血清，經“2.3”項下方法處理后測定藥物峰面積A1，同時取適量對照品溶液及內標溶液，于50 ℃水浴中氮氣吹干，用流動相溶解成相同濃度進樣測定藥物峰面積A2，A1/A2即得絕對回收率。泊沙康唑的平均絕對回收率為94.58%。

2.8 穩定性試驗

取泊沙康唑對照品儲備液制備低、中、高3種濃度的對照品血清，于室溫放置0、12、24 h后按“2.3”項下方法處理進行測定，考察對照品血清在室溫放置24 h的穩定性，測得泊沙康唑的RSD分別為2.54%、1.87%和1.32%，表明血清樣品在室溫放置24 h基本穩定。將低、中、高3種濃度的對照品血清，于-20 ℃冰箱冷凍儲存，放置0、5、10 d后解凍測定，考察血清樣品在凍融后的穩定性，泊沙康唑的RSD分別為2.61%、2.74%、1.95%，表明泊沙康唑對照品血清在-20 ℃下穩定。

2.9 樣品血藥濃度檢測

取患者血清按“2.3”項下方法處理后進樣分析，得泊沙康唑峰面積為45.46，內標峰面積為60.32，用已建立的標準曲線計算樣品中泊沙康唑的含量，計算得該患者的泊沙康唑血藥濃度為1.18 μg·mL-1。

3 討論

3.1 檢測方法

三唑類抗真菌藥物在臨床使用廣泛，可與體內P-450蛋白血紅素輔基Fe原子配位結合，具有一定的肝、腎毒性[10]。有研究[11]表明泊沙康唑的臨床療效和不良反應與血藥濃度顯著相關，對其進行血藥濃度監測很有必要。目前國內外已發表的文獻[8-9]有采用高效液相-質譜/質譜聯用的方法檢測泊沙康唑的血藥濃度，儀器設備比較昂貴，檢測費用也相對較高，基層醫院一般不具備這樣的條件，也不利于治療藥物監測在基層醫院的推廣。對于基層醫院來說，采用高效液相色譜法經濟適用，更適用于泊沙康唑血藥濃度的常規檢測。

3.2 生物樣品預處理

去蛋白處理是生物樣品處理的常規預處理方法，由于血液標本含有大量的蛋白質，而蛋白質在測定過程中能形成泡沫、渾濁或沉淀，如果直接進樣，蛋白質會逐漸沉積在色譜柱上，不僅影響柱效，還會使色譜柱逐漸阻塞，導致柱壓上升，最終無法使用，所以常規要去蛋白處理。常用的去蛋白處理方法有沉淀法和提取法。本研究曾嘗試有機溶劑提取法，采用氯仿、氯仿和乙酸乙酯等比例混合等提取血清中藥物，但因為操作步驟較多，且回收率低，雜質峰多，最終未采用。有文獻[12]報道采用高氯酸酸化后，加入甲醇沉淀蛋白，本研究為了簡化步驟直接采用乙腈沉淀蛋白，較為簡便快捷，便于氮氣吹干濃縮純化，峰型較好，雜質峰無干擾。

3.3 血藥濃度范圍

英國醫學真菌學會發布的《抗真菌治療藥物監測指南》[13]推薦泊沙康唑的預防和治療有效濃度分別為＞ 0.7 μg·mL-1和＞ 1.0 μg·mL-1。有文獻[14]報道了1548份血標本泊沙康唑的平均濃度為0.64 μg·mL-1，只有18.90%的標本濃度大于1.25 μg·mL-1，最高濃度為6.57 μg·mL-1，檢測方法的最低定量下限為0.125 μg·mL-1。本研究建立的方法，泊沙康唑的檢測線性范圍為0.125～50.000 μg·mL-1，最低定量限與文獻報道相同，而最高檢測濃度達到50 μg·mL-1，完全能滿足臨床患者的檢測需要。通過治療藥物監測，臨床可以及時調整藥物用量，改善療效，減少不良反應的發生，保障患者的用藥安全有效。