加載miRNA-21殼聚糖基納米粒對牙周膜干細胞成骨分化的影響

吳廣升，王亞男，惠光艷，梅 濤，王忠山

miRNA是一種由21～25個核苷酸組成的較小的內源性非編碼RNA，可以通過提高或抑制目的mRNAs的降解而調控增殖、分化、凋亡及癌變等一系列的細胞活動[1-2]。miRNA在干細胞成骨分化過程中發揮了非常重要的作用，已經被廣泛應用于骨再生方面的研究，多種miRNA具有促進干細胞成骨分化的作用[3-4]。但由于游離miRNA存在極易降解性、細胞難以攝取，潛在的免疫源性等缺陷，必須采用合適的載體才能提高miRNA轉染效率。殼聚糖(CS)是一種純天然高分子多糖，自身帶正電荷，可以作為RNA、DNA、生長因子及抗腫瘤藥物載體[5]。CS基納米粒作為一種非病毒載體，避免了外源基因序列的插入，但將其應用于miRNA轉染體系仍存在轉染效率不高的問題[6]。基因反向轉染技術是先將DNA(或RNA)通過基質錨定在一定界面上，再將細胞接種于該基質表面，細胞貼壁的同時攝取錨定在介質表面DNA(或RNA)而實現基因轉染。與常規轉染方法相比，該轉染體系可更有效地接觸細胞表面從而達到更高的轉染效率和更低的細胞毒性等效果[7-8]。miR-21是一種具有促進成骨分化作用的miRNA，可上調成骨相關基因表達，在體內可促進骨組織再生[9]。本實驗制備殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質酸/miR-21納米粒(CTH/miR-21 NPs)并對牙周膜干細胞(PDLSCs)進行反向轉染，觀察其轉染效率及促進成骨基因表達作用，為CTH/miR-21 NPs進一步應用于促進牙周組織再生提供經驗。

1 材料與方法

1.1主要材料與設備 CS(醫用級，脫乙酰度≥90%，分子量約100 kDa，金殼藥業，浙江)，透明質酸(HA,分子量約10 kDa，福瑞達醫藥，山東)，α-MEM培養基、胎牛血清、PBS、雙抗(Hyclone,美國)；L-谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、Ⅰ型膠原酶(COLⅠ)和Dispase酶(Sigma，美國),0.25%胰蛋白酶(雷根，北京)；乙酸(優級純，國藥集團)，CO2恒溫細胞孵箱(Thermo Forma，美國),miR-21(吉瑪制藥，上海)；超凈工作臺(博科生物，山東)；熒光顯微鏡(Olympus，BX51，日本),倒置相差顯微鏡(Olympus，日本),掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800，日本)；離心機、反轉錄PCR儀(Eppendorf，德國),實時熒光定量分析儀(Bio-rad，美國),納米粒徑測量儀(Zetasizer NanoZS90, Malvern Instrument，英國)。

1.2CTH/miR-21 NPs的制備及鑒定 參考相關文獻[6]制備方法，采用離子交聯的方法制備CTH/miRNA-21 NPs。將適量CS溶于0.1 mol/L的乙酸溶液中，制備1 mg/ml的CS乙酸溶液。再將適量三聚磷酸鈉(TPP)和HA分別溶于去離子水，獲得1 mg/ml的TPP和HA溶液。將CS、TPP和HA按體積比1∶0.1∶0.025，1∶0.15∶0.025，1∶0.15∶0.05，1∶0.15∶0.1，1∶0.15∶0.15及1∶0.15∶0.5的比例進行混合。置于磁力攪拌器上以3000 r/min的速度攪拌10 min，形成乳光色的CTH NPs懸液。將適量濃度為20 μmol/ml的miR-21加入CTH NPs中(N∶P=20∶1，即氮/磷，指CS中正電荷的氨基與miR-21中負電荷的磷酸基的摩爾比為20∶1)，并用移液器抽吸混勻，振蕩器上震蕩10 s后室溫下靜置60 min，獲得CTH/miR-21 NPs。采用激光粒度儀檢測CTH/miR-21 NPs粒徑和電位。

1.3CTH/miR-21 NPs反向轉染體系的制備及鑒定 將適量的CTH/miR-21 NPs(含300 pmol miR-21)混入100 μl的0.2%明膠溶液中，震蕩混勻后滴加入6孔板中，涂覆均勻，超凈工作臺內風干后戊二醛固定，噴金，掃描電鏡觀察。

1.4PDLSCs的原代培養及鑒定 收集4例18～22周歲(已簽署知情同意書)因正畸治療需要拔除的前磨牙或埋伏阻生的第三磨牙。超凈工作臺內用11號手術刀片刮取牙根中1/3處的牙周膜組織，并剪成體積0.5～1 mm3的組織碎片，移入15 ml離心管并滴加5 ml含有1% Dispase和1% COLⅠ的混合消化液，37℃環境下消化45 min，其間每隔15 min輕輕震蕩數次，重懸后接種于6孔板中(含10% FBS，1%雙抗)，在37℃、5% CO2環境下培養，細胞匯合至80%后胰酶消化法傳代。采用有限稀釋克隆法獲取3～5代PDLSCs用于后續實驗。采用流式細胞分析儀對細胞表面標記分子進行檢測。采用胰酶消化法收集第3代PDLSCs，PBS洗3遍，PBS重懸、計數，與CD31、CD34、CD45、CD29、CD90以及CD105室溫避光孵育40 min后，將PDLSCs轉移至流式管中，采用流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達水平。成骨誘導:選取第3代PDLSCs，當細胞融合約90%時，用成骨誘導液繼續培養21 d，4%多聚甲醛固定后茜素紅染色。成脂誘導:選取第3代PDLSCs，當細胞融合約90%時，用成脂誘導液繼續培養2周，4%多聚甲醛固定后油紅O染色。

1.5PDLSCs攝取CTH/miR-21 NPs的情況 將CTH/miR-21 NPs(已用FITC標記CS， Cy-3標記miR-21)以300 pmol/孔的量加入6孔板，并加入適量的0.2%明膠溶液交聯，干燥。PDLSCs以2×105/孔的濃度接種到6孔板中，37℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養24 h。吸出原培養液，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，每孔加500 μl DAPI，PBS沖洗3遍，去除多余的DAPI。熒光顯微鏡下觀察PDLSCs中DAPI(藍色熒光)、FITC(綠色熒光)及Cy-3(紅色熒光)的分布，拍照。

1.6CTH/miR-21 NPs轉染PDLSCs效率鑒定 采用流式細胞儀觀察CTH/miR-21 NPs轉染PDLSCs的效率。按照上述方法將CTH/miR-21 NPs(Cy-3標記)以0、150、300、450 pmol/孔的量反向轉染PDLSCs 24 h，PBS輕輕洗滌2次、重懸，4%多聚甲醛固定。濃度為0 pmol/孔組為陰性對照，根據PDLSCs發射出來的紅色熒光的比率測定轉染效率。每個樣本重復檢測3次。

1.7CTH/miR-21 NPs轉染PDLSCs后成骨相關基因的表達 采用RT-PCR方法檢測CTH/miR-2 NPs轉染PDLSCs后成骨基因表達水平。將CTH/miR-21 NPs以0、150、300、450 pmol/孔的量加入6孔板中，并用0.2%明膠溶液交聯。PDLSCs以2×105/孔的濃度接種到6孔板中，37℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養3 d。吸棄原培養液，PBS沖洗3遍，以用500 μl/孔的量加入TRIzol裂解細胞，收集細胞內的總RNA。采用PrimeScript RT試劑盒反轉錄為cDNA。成骨相關基因RUNT相關轉錄因子2(RUNX2)、骨橋素(OPN)、骨鈣素(OCN)、COLⅠ的表達水平用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行檢測。實驗中使用的上游和下游引物序列見表1。數據分析采用iQTM5光學系統軟件2.0。數據中所有目的基因表達水平均通過管家基因GAPDH進行校正。

表1 成骨相關基因引物序列

2 結果

2.1CTH/miR-21 NPs粒徑及電位檢測結果 CTH/miR-21 NPs的粒徑和Zeta電位由CS、TPP和HA三者之間的體積比所決定。隨著HA比率的增高，CTH/miR-21 NPs的粒徑由147.3 nm增加至288.5 nm，而Zeta電位由44.5 mV逐漸降低至21.7 mV。當CS∶TPP∶HA為1∶0.15∶0.025時，CTH/miR-21 NPs的粒徑最小。見圖1。

圖1 CTH/miR-21 NPs的粒徑及Zeta電位CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質酸/miR-21納米粒，CS為殼聚糖,TPP為三聚磷酸鈉，HA為透明質酸

2.2CTH/miR-21 NPs反向轉染體系的形態學特征 CTH/miR-21 NPs呈球形均勻地分布在培養板表面，納米球的周緣被明膠部分包繞。見圖2。

圖2 交聯在培養板上的CTH/miR-21 NPs形態特征CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質酸/miR-21納米粒

2.3PDLSCs特性鑒定 PDLSCs陰性表達造血干細胞表面標記物：CD31、CD34、CD45；陽性高表達間充質干細胞表面標記物：CD29、CD90、CD105，證明本實驗原代培養的細胞具有間充質來源的干細胞特征。見圖3。本研究所培養人PDLSCs呈典型長梭形，經體外成骨誘導21 d后，茜素紅染色陽性，密集排列的細胞表面形成不規則紅色礦化結節；PDLSCs經成脂誘導14 d后，油紅O染色陽性，PDLSCs細胞內及細胞間散在分布大小不等的圓形紅色脂滴，證實PDLSCs具有多向分化潛能。見圖4。

圖3 PDLSCs表面標記物表達情況PDLSCs為牙周膜干細胞；A.陰性表達造血干細胞表面標記物；B.陽性高表達間充質干細胞表面標記物

圖4 PDLSCs培養及鑒定PDLSCs為牙周膜干細胞；A.第3代PDLSCs；B.礦化結節茜素紅染色；C.油紅O染色

2.4PDLSCs攝取CTH/miR-21 NPs情況 熒光顯微鏡下，PDLSCs的細胞核被DAPI染成藍色(圖5A)，CTH/miR-21 NPs中被FITC標記的CS呈綠色(圖5B)，Cy-3標記miR-21呈紅色(圖5C)，圖5D為圖5B和圖5C融合之后，綠色和紅色完成重合，證實miR-21與CTH NPs完整地結合在一起并被細胞攝入。圖5E為圖5A、5B、5C融合，藍色的細胞核周圍綠色及紅色熒光聚集，說明PDLSCs可以吞噬大量的CTH/miR-21 NPs。流式細胞儀檢測細胞轉染效率，300和450 pmol/孔可以達到90%以上的轉染效率，高于0、150 pmol/孔(P<0.01)。見圖5F。

圖5 PDLSCs攝取CTH/miR-21 NPs情況及CTH/miR-21 NPs轉染效率A.DAPI標記細胞核(藍色)；B.FITC標記CS(綠色)；C.Cy-3標記miR-21(紅色)；D.為圖B和圖C融合；E.為圖A、B、C融合；F.不同濃度CTH/miR-21 NPs轉染效率；PDLSCs為牙周膜干細胞，CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質酸/miR-21納米粒；與0 pmol/孔比較，bP<0.01；與150 pmol/孔比較，dP<0.01

2.5反向轉染后PDLSCs成骨相關基因表達水平 與0 pmol/孔組比較，300、450 pmol/孔組RUNX2、OPN、OCN和COLⅠ水平及150 pmol/孔OPN和COLⅠ水平上調，且300、450 pmol/孔組OPN、OCN水平高于150 pmol/孔組(P<0.05，P<0.01)。見圖6。

圖6 不同濃度CTH/miR-21NPs對PDLSCs成骨相關基因表達情況PDLSCs為牙周膜干細胞，CTH/miR-21 NPs為殼聚糖/三聚磷酸鈉/透明質酸/miR-21納米粒，RUNX2為RUNT相關轉錄因子2，OPN為骨橋素，OCN為骨鈣素,COLⅠ為Ⅰ型膠原酶；與0 pmol/孔組比較，aP<0.05，bP<0.01；與150 pmol/孔組比較，cP<0.05

3 討論

牙周炎是導致成人牙齒松動和脫落的主要原因之一，如何使缺損的牙周組織再生是一個具有重大挑戰性的臨床問題。隨著組織工程技術和生物材料學的不斷發展進步，牙周組織再生研究進入了高速發展的新階段。PDLSCs是存在于牙周韌帶組織中的間充質干細胞(MSCs)，具有很強的自我更新能力以及多向分化潛能，可以分化為牙骨質和牙周膜。PDLSCs被公認為目前牙周組織工程中最佳的種子細胞[10]。但PDLSCs需要在特定的微環境誘導下才能持續進行成骨分化。

近年來，基因轉染技術在生物醫學領域得到越來越廣泛應用。傳統的基因轉染方法是陽離子聚合物或脂質體等通過靜電作用結合RNA或DNA形成納米復合體，隨后加入細胞培養基中，依靠重力作用沉降至已經貼壁細胞的表面，再通過胞吞作用進入細胞，這種基因轉染方法被稱為正向轉染。然而，其缺陷在于復合物粒徑不穩定，并且為了獲得較高轉染效率需要提高復合體濃度而引起一定的細胞毒性。反向轉染具有以下優勢：①載體/基因復合體更加穩定，并還可以在固定位置釋放基因；②與細胞膜直接接觸，便于細胞內吞，提高轉染效率；③轉染過程可以在血清環境中實現[7-8]。

miRNA可以調控多種干細胞成骨分化，為了克服游離的miRNA存在的極易降解性、細胞難以攝取和潛在的免疫源性等不足，采用合適的載體負載miRNA后再進行轉染是最普遍的方法。Wu等[11]將脂質體/miRNA復合物通過凍干的方式結合培養板表面，隨后將骨髓間充質干細胞(BMSCs)接種于該培養板表面進行反向轉染，獲得了更高的轉染效率及更低的細胞毒性，并且凍干后的脂質體/miRNA復合物在4℃或-20℃條件下保存90 d后仍然可以反向轉染MSCs，且轉染效率沒有太大變化。Wu等[12]又通過將脂質體/miRNA凍干在經過微弧氧化形成的微孔氧化鈦表面，制備miRNA功能化的微孔鈦種植體。微孔氧化鈦表面為miRNA負載提供了更大的表面積，使miRNA能夠在孔隙內保留，直到細胞轉染完成。將MSCs接種到miRNA功能化的微孔氧化鈦表面后，觀察到更高的miRNA轉染效率，且沒有明顯的細胞毒性。同時可以上調MSCs成骨相關基因的表達，促進堿性磷酸酶的產生、膠原分泌和細胞外基質礦化等。

CS基納米粒作為一種非病毒載體，已經被應用于miRNA正向轉染體系的研究中，但其轉染效率接近70%[13-15]。Wang等[16-17]以CS-HA為載體，制備了CS/HA-miRNA NPs反向轉染體系。先將CS/HA-miRNA NPs交聯在微孔氧化鈦表面，發現對人MSCs的轉染效率≥90%。將CS/HA-miRNA NPs交聯培養板上對骨髓MSCs細胞膜片的轉染效率進行觀察，發現轉染效率在80%以上，且均可以顯著提高MSCs的成骨相關基因的表達水平。

miRNA對多種干細胞的分化具有調控作用[4]，miR-21是一種具有很強的促進成骨分化作用的miRNA，可以上調成骨相關基因的表達[18]。Yang等[9]以慢病毒作為載體，構建miRNA-21/LacZ轉染體系并轉染BMSCs，在體外顯著提高了骨形成蛋白-2(BMP-2)、RUNX2、OCN、OPN、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內皮生長因子(VEGF)表達水平；用miRNA-21/LacZ轉染大鼠BMSCs，再種植于β-磷酸三鈣支架材料內，最后植入修復大鼠顱骨極限缺損處，取得了顯著的促進骨再生效果。

本研究選擇miR-21作為反向轉染PDLSCs的目的基因，實驗結果證實CTH/miR-21 NPs可以成功地轉染PDLSCs，并顯著提高相關成骨基因的表達水平，為反向基因轉染技術應用于牙周組織再生提供了新的思路。