丹酚酸B對神經退行性疾病的保護作用研究進展

南亞強，陶計委，周 杰

神經退行性疾病是一類與遺傳、年齡、免疫及環境等多因素相關的大腦及脊髓神經元慢性、不可逆性變性丟失的神經系統疾病，包括阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)、多發性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)、亨廷頓病(Huntington disease, HT)以及脊髓側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis， ALS)等，其神經病理涉及遺傳變異、衰老、氧化應激、神經炎癥免疫、病理蛋白異常聚集、線粒體功能障礙、細胞凋亡及自噬異常等多種復雜機制[1]。近年研究發現腸道微生物也參與了神經退行性疾病的發生發展[2]。神經退行性疾病共同的結局為中樞神經元的致死性變性，導致運動及認知功能障礙，嚴重降低了患者的生存質量，給家庭及社會帶來了較大負擔。現階段對神經退行性疾病的治療措施大多針對某單一靶點，治療效果不佳，基于其復雜的病因機制，近年來從傳統中藥中尋找新的具有多靶點效應藥物防治神經退行性疾病越來越受到關注。丹酚酸B是傳統中藥丹參中含量最高的生物活性成分，具有抗氧化活性、抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、抗纖維化及抑制血小板聚集等多種生物活性，對AD、PD、MS等神經退行性疾病具有有效的神經保護作用[3]。本研究就丹酚酸B對神經退行性疾病的神經保護作用機制的研究進行綜述。

1 概述

丹酚酸B源于傳統中藥材唇形科鼠尾草屬丹參的干燥根莖，由3分子丹參素及1分子咖啡酸組成，分子式為C36H30O16，分子量為718.62，熱穩定性差、吸濕性強、可溶于水、呈白色粉末狀[4]。丹酚酸B生物毒性低，因富含酚羥基團和電離出H+而具有抗氧化活性，其抗氧化活性強于天然抗氧化物維生素C、銀杏葉提取物等物質，可通過血腦屏障，能有效地修復血腦屏障損傷，抑制細胞內Ca+超載、自由基過度生成，促進神經發生、血管再生，促使抗氧化物質生成，改善線粒體能量供應，臨床中被用于治療心腦血管疾病[5]，《中國藥典》將其作為鑒定丹參品質的主要依據。蛋白質相互作用網絡基因本體功能富集分析顯示丹酚酸B通過調控細胞信號轉導、細胞通訊、細胞代謝、細胞增殖及凋亡等細胞病理生理過程發揮生物活性效應[6]，從而對神經細胞、心肌細胞、肺泡上皮細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞、血管內皮細胞及骨細胞等多個系統組織的細胞具有保護作用,研究證實丹酚酸B對AD、PD、MS等神經退行性疾病的病理改變有顯著的緩解作用[7]。

2 對神經退行性疾病的神經保護作用機制

2.1抑制病理蛋白異常聚集 β-淀粉樣蛋白(Aβ)、α-突觸核蛋白(α-Syn)的異常累積及清除障礙是AD、PD的典型病理特征，Aβ、α-Syn均可通過觸發氧化應激、損傷線粒體、激活神經膠質細胞、干擾大腦葡萄糖代謝、擾亂鈣離子穩態以及誘導神經元凋亡等多種途徑導致神經元發生變性死亡。AD病理相關的β分解蛋白1(BACE1)分解淀粉樣前體蛋白(APP)生成可溶性淀粉前體(sAPPβ),sAPPβ由γ分解酶分解成Aβ肽段，可溶性Aβ肽段聚集形成的多聚物是導致AD認知功能障礙的重要因素。PD的α-Syn病理不僅存在于中樞神經系統，在腸道黏膜、唾液腺及皮膚等外周組織中同樣被檢測到，并以類似朊病毒樣方式在神經元之間傳播，誘導異常突觸核蛋白單體的錯誤折疊和聚集，產生神經毒性損傷[8]。丹酚酸B可抑制Aβ、α-Syn的形成，并可增強機體對這些異常蛋白的清除能力。Tang等[9]構建過表達APP的人神經母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y)研究發現，丹酚酸B可通過抑制糖原合成酶激酶3(GSK-3β)的絲氨酸9位點磷酸化而抑制BACE1的活性及其表達，從而降低了sAPPβ水平，減少了Aβ40、Aβ42亞型生成。另有研究報道，丹酚酸B在無顯著毒性的情況下可在表達APP的不同類型神經細胞及非神經細胞株中發揮調節BACE1活性及顯著降低Aβ40、Aβ42水平的作用，而且在不影響γ分泌酶活性的情況下逆轉Aβ生成發揮正性調節作用[10]。BACE1在大腦中高表達，是Aβ生成的重要限速酶，因此針對BACE1是治療AD的重要靶點之一，同樣，抑制α-Syn的形成及促進其清除也是治療PD的關鍵環節。丹酚酸B可抑制α-Syn原纖維的形成并能減輕其神經毒性，不僅可降低磷酸化的不溶性α-Syn水平下降，而且可以與α-Syn單體結合抑制原代神經元細胞內的α-Syn聚集[11]。Wu等[12]在PD的細胞及動物模型研究中也觀察到了丹酚酸B對α-Syn形成及聚集的抑制作用，并且發現丹酚酸B可通過增強分子伴侶介導的自噬作用促進細胞內溶酶體對α-Syn聚集體的降解。丹酚酸B有效抑制和清除AD、PD相關的異常蛋白生物效應可能與其具有較強的清除自由基功能密切相關，也不排除某個結構域可能與這些病理蛋白形成過程中的關鍵分子存在相應的結合部位。

2.2抗氧化 活性氧(ROS)、活性氮(RNS)在細胞的發生、分化、發育、成熟及衰老過程中有雙重效應。適量ROS是調控細胞內氧化還原信號、驅動組織細胞修復的關鍵因子，環境毒素、機體衰老等促使細胞產生過量ROS可導致細胞內氧化與抗氧化穩態失衡、氧化還原性信號控制通路中斷，造成組織細胞的DNA、RNA、蛋白質、脂類等重要分子喪失功能[13]，而大腦高耗能、高耗氧的代謝特性以及富含不飽和脂質、自身抗氧化能力弱等內在因素使得神經元及神經膠質細胞更容易遭受氧化應激損傷，因此，抑制和清除自由基是緩解細胞氧化應激的直接方法。丹酚酸B作為天然抗氧化劑在神經系統中可抑制和清除自由基，抑制催化ROS、RNS生成的一氧化氮合酶(NOS)、NADPH氧化酶(Noxs)等氧化酶活性，增強超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性，并促進膽綠素及膽紅素等內源性抗氧化劑的生成[14-15]。He等[16]用Aβ誘導原代培養的小鼠神經元建立AD的體外細胞模型，研究指出丹酚酸B通過抑制ROS的生成、線粒體的脂質過氧化以及促進谷胱甘肽(GSH)生成而緩解了Aβ介導神經元的氧化應激損傷，減少了神經元突觸的變性丟失。另一項研究采用SH-SY5構建PD的細胞模型，體外實驗研究發現用丹酚酸B預處理SH-SY5Y細胞，可顯著減少6-羥多巴胺(6-OHDA)誘導的ROS生成，明顯增強了細胞活性[17]。

丹酚酸B還可調控一些抗氧化通路的信號轉導而發揮抗氧化作用。Nrf2/ARE、NF-κB/IκB、PI3K/Akt等信號通路的激活與氧化應激損傷密切相關，其中Nrf2/ARE信號通路是機體細胞維持氧化還原穩態、防御氧化應激損傷和抑制炎癥反應的重要途徑之一[18]。Nrf2作為一種核轉錄因子可上調內源性抗氧化劑及一些修復酶相關基因的表達，同時參與正性或負性調節p62、PKC、PI3K/Akt/GSK-3β、NF-κB和p38 MAPK等信號通路，調節Nrf2相關通路是預防或減緩AD、PD等神經退行性疾病的潛在治療靶點[19]。Zhou等[20]在PD模型的體內外研究中證實，丹酚酸B可促進神經膠質細胞質內Nrf2向細胞核轉位，對多巴胺能神經元具有保護作用，并可改善PD動物模型的運動功能障礙，由此我們可以推測丹酚酸B對PD的神經保護作用可能基于激活Nrf2/ARE抗氧化相關通路，通過調節Nrf2的質核穿梭可能在細胞核層面發揮神經保護作用。

2.3保護線粒體 線粒體是細胞的能量來源，中樞神經過量ROS與氧化應激相互促進的惡性循環損傷、慢性神經炎癥等引起的線粒體氧化磷酸化功能異常以及損傷后線粒體未折疊蛋白反應(UPRmt)的異常或延遲激活是神經元功能喪失的重要原因[21]。Aβ是內源性自由基產生的強誘導劑，可引起Tau蛋白過磷酸化，促使線粒體功能異常，另外，線粒體分裂相關動力樣蛋白1(Dlp1)過表達以及糖原合成酶激酶3(GSK-3β)活性增強均促進Tau蛋白過度磷酸化，最終導致AD的線粒體功能障礙，引起神經元凋亡、變性、死亡。抑制或清除ROS、Aβ內生、Tau蛋白過磷酸化及Dlp1的過表達是恢復并維持線粒體功能的重要途徑。丹酚酸B可恢復和維持AD病理相關的線粒體膜電位，促進ATP的生成以及修復細胞色素C氧化酶和F1Fo ATP合酶的酶活性，抑制神經元線粒體Dlp1的表達及過磷酸化[16]。楊軍嶺和楊俠[22]用1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導PC12細胞建立PD的細胞模型研究發現，丹酚酸B可緩解細胞受毒性損傷后的線粒體膜低電位情況，緩解ATP的合成功能障礙，維持線粒體DNA水平及線粒體發生相關基因的表達，并可促進受損后線粒體融合相關蛋白Opa-1和Mfn-1的表達，抑制線粒體分裂相關蛋白Drp-1和Fis-1的表達。表明丹酚酸B可通過抑制和清除自由基、抑制蛋白異常聚集及調控相關酶的活性、穩定線粒體功能等多種途徑在線粒體功能修復方面發揮良好的生物效應。

2.4控制神經炎癥 炎癥是神經退行性疾病病理發生發展的主要驅動因素，包括AD、PD、MS、HT、ALS等神經退行性疾病均與慢性炎癥相關。大量神經病理研究，證實小膠質細胞的激活在神經退行性疾病的炎癥反應病理機制中起著十分重要的作用。慢性神經炎癥不僅長期反復激活小膠質細胞和星形膠質細胞，促使膠質細胞持續釋放炎性介質，而且可觸發中樞神經發生氧化應激反應，而過量的ROS及RNS可反過來活化小膠質細胞、星形膠質細胞和外周免疫細胞CD4+T細胞等[22]，進一步加劇了組織細胞的炎性損傷。丹酚酸B可調控TLR4/NF-κB信號通路緩解脂多糖誘導單核巨噬細胞產生的炎癥反應，通過下調TLR4、p-p65、p-IκBα的表達，進而抑制白介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的生成[23]。Zhou等[20]研究報道，丹酚酸B在體內、外可通過激活Nrf2/ARE抗氧化信號通路對PD相關模型的神經炎癥損傷起雙重保護作用，一方面，丹酚酸B可通過上調Nrf2表達而緩解小膠質細胞活化，并抑制小膠質細胞產生TNF-α、IL-1β、一氧化氮(NO)等炎性介質而控制神經炎癥；另一方面，丹酚酸B可促進星形膠質細胞分泌具有神經保護作用的膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)。由于Nrf2在調節炎癥反應、細胞能量代謝、鐵代謝、蛋白質穩態及線粒體生物能學等相關的基因表達方面發揮多種作用，探索丹酚酸B對Nrf2相關通路調節作用對抑制神經退行性疾病的神經炎癥的發生發展有重要意義。上述研究提示，Nrf2與NF-κB信號通路交互作用是神經退行性疾病氧化應激與神經炎癥發生的重要環節，更重要的是關于丹酚酸B對Nrf2與NF-κB調控機制的研究從控制神經膠質細胞活化減輕神經炎癥角度為PD等神經退行性疾病的治療提供了新策略。

2.5調節免疫 先天性免疫和適應免疫不同程度的參與了AD、PD、MS的起病，機體免疫與炎癥息息相關。CD4+T細胞在神經元的變性過程中扮演著重要的角色，可分化為具有促炎效應的Th1和Th17兩種細胞表型，同時可形成具有抗炎效應的Th2和調節性T細胞(Treg)。Th1和Th17介導的神經元發生免疫炎癥性的脫髓鞘病理在MS中具有特征性表現，Th1不僅可活化小膠質細胞而且可激活星形膠質細胞，Th17主要對星形膠質細胞的活化起主要作用，目前MS的疾病修飾治療主要依賴于調節免疫系統[24]。早期動物研究顯示丹酚酸B具有抗疲勞及調節免疫的功能[25]。Dong等[26]采用小鼠構建實驗性自身免疫性腦脊髓炎作為多發性硬化的動物模型，丹酚酸B治療后實驗動物的臨床評分明顯改善，中樞神經系統炎性細胞的浸潤明顯下降，有效且特異性地抑制了Th1、Th17細胞的反應。該研究表明丹酚酸B可能通過有效抑制神經損傷病理中的Th1細胞反應參與抗炎及調節免疫作用，有望成為MS/EAE患者的一種有效的治療劑。

2.6抗細胞凋亡 神經退行性疾病神經病理的最終結果是神經元的死亡，其形式主要有凋亡、壞死、自噬。近年研究發現，細胞鐵死亡是區別于前三種經典細胞死亡方式的另一種新的程序性死亡類型，與神經退行性疾病的病理性細胞凋亡也密切相關。研究證實神經退行性疾病患者的神經元大多數表現出凋亡的形態學特征和促凋亡因子高表達狀態，許多信號分子與神經元的凋亡相關，包括促凋亡的casepase家族、Bax、Bad、Fas、Par-4、p53、谷氨酸受體樣蛋白，以及抗凋亡相關的Bcl-2、Bcl-XL、凋亡抑制因子、端粒酶、蛋白激酶C、抗氧化酶和鈣結合蛋白[27]。中樞神經組織細胞的再生能力非常有限，所以限制神經元的死亡是治療神經退行性疾病的關鍵。Tian等[17]研究表明，丹酚酸B在抑制ROS生成的同時可通過抑制caspase-3活性、降低細胞色素C從線粒體向細胞的轉位、下調Bax/Bcl-2比值等方式抑制6-OHDA誘導的細胞凋亡。Zeng等[28]隨后用MPP+誘導SH-SY5Y構建PD的體外模型，同樣發現丹酚酸B恢復了毒性損傷后的細胞活力，恢復了線粒體功能，抑制了ROS含量的增高，并發現其可抑制細胞色素C的釋放和caspase-3的活化，顯著降低了促凋亡因子Bax水平，降低了Bax/Bcl-2 mRNA含量的比值,顯著抑制了細胞凋亡。

2.7促進神經元分化增殖 針對神經退行性疾病是由于神經元變性退化及出現功能障礙導致的，采用神經細胞移植治療一直是相關領域研究的前沿和熱點，伴隨著將人體自身成熟細胞轉化為誘導多能干細胞(iPSC)技術日趨成熟，iPSC應用有望為神經退行性疾病治療帶來希望。研究發現，iPSC可誘導為神經元和神經膠質細胞，其分化為具有中腦特征的多巴胺神經元經移植后可整合在PD模型宿主大腦并能改善PD模型行為[29]。然而，iPSC的神經分化速度在現階段的技術情況下限制了其實用性。Shu等[30]研究發現在iPSC神經分化過程中加入丹酚酸B可顯著促進iPSC向神經干細胞分化，并可進一步促進神經干細胞向神經元的分化和增殖，其機制可能是丹酚酸B激活AKT/GSK3β信號相關通路。丹酚酸B促進iPSC及神經干細胞的增殖分化效應為細胞移植治療神經退行性疾病帶來了新的轉機。

2.8調節腸道微生物 腸道微生物穩態紊亂與PD、AD以及MS等神經退行性疾病密切相關，衰老過程對機體腸道微生物組成和功能具有顯著影響，而腸道微生物與大腦通過多種途徑存在生物信息雙向交流，腸道微生物及其代謝產物在神經發生、神經免疫及神經內分泌等方面起著至關重要的作用，因此腸道微生物的構成、豐度及多樣性改變可能是PD等神經退行性疾病發生發展的重要推手[31]，基于一些特定基因的缺失或功能障礙，腸道微生物的感染導致的免疫功能異常可能是引發PD多巴胺能神經元變性的扳機[32]。趙孟浩等[33]對PD模型小鼠經灌胃方式給予不同劑量的丹酚酸B治療后，檢測血液及不同臟器組織中丙二醛(MDA)、GSH含量，提取腸道菌群基因組進行高通量二代測序分析菌群差異，結果顯示丹酚酸B可明顯降低血清中MDA水平，并影響腸道菌群多樣性及豐度，提高了具有抗炎、抑制脂多糖生成的菌群豐度。另外該項研究顯示，丹酚酸B顯著提高了具有抗炎作用的狄氏副擬桿菌豐度，而另一項臨床配對比較研究顯示MS人群的腸道中狄氏副擬桿菌豐度明顯低于健康對照人群，體外實驗研究顯示狄氏副擬桿菌可刺激Treg細胞表達抗炎因子IL-10，從而發揮免疫調節和抗炎作用[34],由此我們推斷丹酚酸B可能有通過調節腸道微生物而緩解MS病理的作用。表明丹酚酸B對腸道微生物的組成及豐度有影響，具體是通過丹酚酸B對腸道微生物群的直接影響還是其在腸道內的次級代謝產物產生的效應需要進一步明確；另外，丹酚酸B是否具有抑制某些對機體有害的微生物代謝產物的生成也值得進一步研究。

3 總結與展望

丹酚酸B多途徑、多靶點的生物活性在防治心腦血管疾病同時對肺、肝、腎等相關疾病的治療中也存在良好的療效，針對老年患者衰老狀態存在多臟器功能減退及功能障礙的情況，未來丹酚酸B在臨床的開發應用更符合對神經退行性疾病等與衰老相關疾病的“全面論治”的臨床治療需要。近年來關于腸道微生物與機體慢性疾病之間的聯系研究證據逐漸確鑿，尤其是AD、PD等與微生物-腦-腸軸的關系爭論激烈，新的研究顯示丹酚酸B的體內抗氧化性可影響腸道微生物菌群，其結果是否與其抑制病理蛋白異常聚集、抗氧化、抗神經炎癥及抗凋亡功能有關還需進一步探究；丹酚酸B上述多種生物活性效應與其在體內的代謝產物的關聯性研究還需明確；丹酚酸B調節內源性物質釋放發揮神經保護活性以及對多種信號通路的影響需更深入的研究。總之，丹酚酸B藥理活性的深入研究及在延緩衰老、防治神經系統疾病的應用具有重要的科學、社會意義。