異花授粉對柚果實代謝產物的影響及其與內裂的關系

劉冬峰 林紹生 陳 巍 朱祝軍 宋 洋 郭秀珠 李發勇

(1浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；2江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400，3 浙江農林大學，浙江 臨安 311300)

裂果是柚果實發育過程中重要的生理病害，主要分外裂和內裂兩種類型[1]。外裂是從果頂開始沿果實縱向由外向內開裂，開裂果實裂口較大，喪失商品性；內裂是果實囊瓣在腹線處開裂，主要是種子敗育后果皮、囊瓣、中心柱生長不協調導致，內裂果實外觀表現正常，但易枯水粒化[2-3]。前人關于多種果實的研究表明，裂果與果肉、果皮中的代謝物含量變化密切相關。隨著果實發育，果肉中可溶性糖、有機酸等物質含量增加，果肉薄壁細胞滲透勢降低、吸水能力增強[4-6]，而果皮中不溶性果膠逐漸轉變為可溶性果膠使果皮韌性降低[7-8]，果肉、果皮生長不協調導致裂果[9-11]。

異花授粉是減輕柚裂果的有效措施，其作用機制可能與花粉直感效應有關[12-13]。異花授粉后，由于花粉直感現象，雜交當代果實在生長發育和品質形成過程中發生明顯變異[14-16]。柑橘果實形狀、果皮厚度、種子數量及可溶性糖、有機酸、揮發性物質等內在品質性狀均表現明顯的花粉直感效應[17-19]。種子是花粉直感效應的重要載體，前人研究認為父本花粉可通過種子影響果實組織從而引起果實性狀變異，種子合成的內源激素、多胺等物質可調節細胞代謝和果實發育過程，起到提高庫容、促進果實生長的作用[20]。柚異花授粉后產生大量飽滿種子，有研究認為大量種子排列在中心柱周圍，能夠緩沖汁胞發育產生的膨壓，起到保護中心柱的物理性作用，從而減輕果實內裂[21]。但柚異花授粉果實種子數較多，導致商品性下降，而種子產生的內源物質對中心柱和汁胞發育的影響，以及汁胞代謝變化與果實內裂的關系還有待進一步研究。本研究分析了早香柚果實種子數與內裂的關系，利用氣相色 譜 -質 譜 技 術 ( gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)測定早香柚無籽內裂果實和多籽不內裂果實汁胞代謝組，從代謝組水平分析異花授粉對柚果實汁胞代謝產物的影響，以期為研究柚內裂發生機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗在浙江省永嘉縣碧蓮鎮早香柚中心產區開展，樹齡25年，處于穩定結果期。花粉來自當地種植的琯溪蜜柚，采集大蕾期花朵的花藥，利用白熾燈烘烤干燥的方法收集花粉。開花期，選取8 株正常早香柚結果樹，其中4 株進行異花授粉，另外4 株疏花后直接套袋作為對照。第二次生理落果后去除套袋，之后田間常規管理。根據前期研究結果，早香柚未授粉果實裂瓣在盛花后105 d 及其后1 個月內發生并結束[22]，即8月中下旬至9月上旬為早香柚果實內裂發生期。因此于早香柚內裂起始期(8月20日)采集自花授粉的無籽內裂果實和異花授粉的多籽不內裂果實，采用GC-MS 方法檢測代謝產物，每個處理測定8 個樣本，分析兩組樣本的代謝產物差異。果實成熟后，采集自花授粉和異花授粉果實各100 個，自花授粉的無籽果實橫切后統計果實裂瓣數，剝取異花授粉果實的飽滿種子，統計異花授粉果實種子數，并分析其與果實內裂的關系。

1.2 樣本制備

代謝組樣品制備參照Lisec 等[23]的方法，稱取液氮研磨的果肉粉末30 mg 于1.2 mL 預冷甲醇中，渦旋10 s。加入60 μL 核糖醇(0.2 g·L-1)作為內標，渦旋10 s，70℃超聲提取30 min。11 000×g離心10 min，取1 mL 上清液于離心管中，加入0.75 mL 氯仿(-20℃預冷)和1.5 mL 蒸餾水(4℃預冷)，渦旋30 s，3 000 ×g離心15 min。取上清液400 μL 于離心管中，氮氣吹干。加入50 μL 15 g·L-1甲氧基吡啶溶液，室溫反應16 h，然后加入50 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氯乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)，室溫反應60 min，再于10 000×g條件下離心10 min。最后取90 μL 上清液進樣，檢測設備為Agilent 7890A/5975C 氣質聯用儀(美國Agilent 公司)，色譜柱為HP-5 MS 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 GC/MS 分析

氣相色譜條件:分流進樣，進樣量1.0 μL，分流比10 ∶1。進樣口溫度280℃，離子源溫度250℃，接口溫度150℃。程序升溫，起始溫度40℃，保持6 min，以10℃·min-1升至300℃，保持6 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL·min-1。質譜條件:電噴霧電離(ESI)源，電子能量為70 eV，全方式掃描，四級桿掃描范圍m/z 35～780。

1.4 數據處理

將原始GC/MS 數據轉換成CDF 格式(Net Channel Definition Format)，利用XCMS 程序(www.bioconductor.org/)進行峰識別、峰過濾、峰對齊，通過手動提取任意質量色譜峰進行驗證并確定XCMS 參數，除默認參數外還進行了如下調整:xcmsSet (fwhm=3，snthresh=3，mzdiff=0.5，step=0.1，steps=2，max=300)，retcor [method = obiwarp，plottype = c(deviation)]，bandwidth=2，minfrac=0.3。利用總和標準比(www.metaboanalyst.ca)方法對原始數據進行歸一化處理。對獲得的保留時間(retention time)、質核比(m/z)、峰強(intensity)等信息的數據矩陣進行代謝物注釋，注釋所用數據庫為NIST 商業數據庫(NIST 2008)和Golm Metabolome Database(GMD)，大量物質由于信號低或沒有數據庫收錄沒被注釋到。利用Simca-P 11.0 軟件進行主成分分析( principal component analysis，PCA)和偏最小二乘方-判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，根據PLS-DA 變量對分組貢獻值(variable importance in the projection，VIP)大小(閾值＞1)和組間變化的顯著性(P＜0.05)篩選顯著差異代謝物，并進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)化合物和代謝途徑注釋。

2 結果與分析

2.1 早香柚果實種子數與內裂的關系

果實成熟期，調查種子數與果實內裂的關系，發現自花授粉的無籽果實全部內裂，異花授粉果實內裂率與種子數量有關。異花授粉果實種子數介于11 ～115粒之間，平均種子數為55 粒/果，種子數少于30 粒時內裂率為100%，高于80 粒時中心柱充實、不內裂，大部分異花授粉果實的種子數介于30 ～80 粒之間，所占比例為72.0%，其中內裂率為51.4%(圖1)。早香柚自花授粉果實的裂瓣數多為2、3 瓣，占內裂果實的57.2%，其次為1、4 瓣，裂瓣數超過5 瓣的果實較少(圖2)，且裂瓣多處于對稱位置，說明果實橫向生長拉力是果實中心柱開裂的直接原因。

2.2 GC-MS 數據多元變量分析

圖1 早香柚異花授粉果實種子數與內裂的關系Fig.1 The relationship between seed numbers and fruit inner-cracking in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

圖2 早香柚自花授粉果實裂瓣數Fig.2 The number of cracked-segments in self-pollinated Zaoxiang pomelo

利用Simca-P 11.0 軟件對所有樣本采用PCA 進行無監督的數據分析，樣品分型前首先對數據進行單位方差縮放(unit variance scaling，UV)，以獲得更加可靠直觀的效果。如PCA 得分圖(圖3-a)所示，所有樣本均處于95%置信區間內，說明模型可用于數據分析。為篩選組間差異代謝物，用PLS-DA 進行有監督的數據分析，并對模型的質量用交叉驗證法進行檢驗，交叉驗證后得到的R2X(模型可解釋的變量)和Q2(模型的可預測度)對模型有效性進行評判。如PLS-DA 得分圖(圖3-b)所示，PLS-DA 模型可以很好地解釋兩組樣本間的差異。對PLS-DA 模型進行置換檢驗(permutation test)驗證模型是否過度擬合，得到PLS-DA 置換檢驗圖，100 次驗證結果顯示，R2 在Y 軸上的截距為0.343，Q2 在Y 軸上的截距為-0.289(圖4)。從各組的模型預測參數的R2X、R2Y、Q2Y 來看，上述評估模型是有效、可靠的，可用于差異變量篩選。

2.3 早香柚果實內裂起始期代謝產物的鑒定

圖3 PCA 得分圖和PLS-DA 得分圖Fig.3 PCA score plot and PLS-DA score plot

圖4 PLS-DA 模型的置換檢驗圖Fig.4 PLS-DA permutation test graph

根據保留時間、質核比和峰強矩陣進行代謝產物注釋，共鑒定到66 種代謝物，包括10 種氨基酸、29 種有機酸、17 種糖類物質、8 種含氮化合物和2種其他物質(表1)。在檢測到的333 個目標化合物中，大量物質由于信號低或數據庫未收錄而沒有注釋到。采用PLS-DA 模型第一主成分的VIP 值(閾值＞1)結合S-plot 和t 檢驗的P值(P＜0.05)尋找差異代謝物。

2.4 異花授粉對早香柚果實代謝產物的影響

由表2 可知，果實內裂起始期，在異花授粉果實中鑒定到12 種顯著差異的代謝產物，包括7 種有機酸(奎寧酸、琥珀酸、檸康酸等)、3 種含氮化合物(2-咪唑烷酮-4-羧酸、2-硫代巴比妥酸和2-羥基吡啶)和2種糖類物質(阿拉伯糖和山梨醇)，其中阿拉伯糖和2-咪唑烷酮-4-羧酸含量顯著上升，奎寧酸、山梨醇等10種代謝物含量顯著下降。

表1 早香柚果實內裂起始期代謝產物鑒定結果Table 1 Identified metabolites from Zaoxiang pomelo during initiation period of inner-cracking

表1(續)

表2 早香柚異花授粉果實中顯著差異代謝物Table 2 Matebolites with significant difference in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

2.5 異花授粉對早香柚果實代謝途徑的影響

從外觀上看，種子有無及多少是早香柚果實內裂的重要影響因素。代謝物含量分析結果表明，異花授粉后果實中多個代謝途徑發生變化(圖5)。在鑒定到的10 種氨基酸中，9 種為呈味氨基酸[24]，包括5 種甜味氨基酸、3 種酸味氨基酸和1 種苦味氨基酸，其中甜味和苦味氨基酸的含量均有所增加，3 種酸味氨基酸中天冬氨酸和天冬酰胺含量增加、谷氨酸含量降低。在鑒定到的29 種有機酸物質中，4 種有機酸參與莽草酸途徑及其下游次生代謝過程，4 種有機酸富集在三羧酸循環代謝通路上，其他大部分有機酸，包括還原糖氧化生成的糖酸、長鏈脂肪酸等含量有所增加。異花授粉后果實糖代謝也發生變化，蔗糖、果糖和葡萄糖3種主要糖分的含量下降，阿拉伯糖、甘露糖、蔗果三糖、核糖等含量有所增加。此外，在有籽果實中還發現腐胺、乙醇胺、碳二亞胺、咪唑衍生物、吡咯啉衍生物等含氮化合物含量增加。

圖5 異花授粉對早香柚果實代謝通路的影響Fig.5 The changes of main metabolic pathways in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

3 討論

有些文旦系列柚類品種具有自交不親和、單性結實能力強的特性，所結的無籽果實存在較為嚴重的果實外裂或內裂問題。前期研究發現早香柚自花授粉的無籽果實幾乎全部內裂，而異花授粉的有籽果實內裂指數顯著下降[22]，但受花期天氣及人工授粉技術的影響，授粉受精不良、果實種子數較少的果實內裂現象仍然比較嚴重。本研究發現，早香柚果實內裂與種子有無及多少密切相關，低于30 粒時內裂率為100%，超過80 粒時果實中心柱充實、不內裂，大部分異花授粉果實的種子數介于30 ～80 粒之間，其中內裂果實占51.4%。

有研究認為裂果與果肉、果皮生長不協調有關[9]。柚果實發育過程中果肉和果皮生長不同步進行，前期以果皮發育為主，玉環柚在7月中旬果皮厚度達到最大，此時果肉僅占總體積的3%～5%，之后果肉發育加快，果皮被壓縮變薄，9月下旬果實縱向生長基本停止，而橫徑繼續擴大導致中心柱開裂[21]。本研究發現，早香柚自花授粉果實裂瓣數多為2、3 瓣，且裂瓣多處于對稱位置，表明果實縱向生長緩慢后果實橫向生長拉力是果實中心柱開裂的直接原因，而在異花授粉果實中，大量飽滿種子排列在中心柱周圍，可緩沖果實橫向生長拉力，使果實內裂率降低，這是種子在減輕果實內裂上發揮的物理性作用。

在代謝水平上，異花授粉后種子產生的激素、多胺等內源物質可調控果實生長發育過程。沙田柚異花授粉后果實中生長促進類激素和多胺含量顯著增加[25-26]，本研究利用GC-MS 非靶向代謝組方法未檢測到內源激素，但發現異花授粉果實中腐胺含量增加。大量研究表明，多胺可促進幼果細胞分裂，與果實膨大密切相關[27]。本研究結果表明，早香柚異花授粉后果實內裂率降低，除種子起到保護中心柱的物理性作用外，可能還與多胺促進細胞分裂使中心柱發育充實有關。

前人研究表明，異花授粉后果實中可溶性糖、有機酸、油脂、蛋白、維生素、揮發性物質以及木質素等物質的含量及組分發生變化，直接影響果實內在品質[19，28-29]。本研究中，早香柚異花授粉后汁胞中可溶性糖、有機酸和氨基酸含量均發生變化，這些物質含量的變化不僅直接影響果實風味，還能作為滲透調節物質參與果肉汁胞發育，這些滲透調節物質的含量變化可能與果實膨大和內裂有關。除初級代謝外，異花授粉產生的大量種子中還含有多種次生代謝物質，包括類檸檬苦素、生物堿、酚酸、類黃酮等[30-31]，這些生物活性物質的合成大多與莽草酸代謝途徑有關。本研究發現，早香柚異花授粉后果實中莽草酸、芥子酸、奎寧酸和苯甲酸含量降低，表明異花授粉后果實中莽草酸途徑及其下游的次生代謝發生變化，但這些代謝變化與果實內裂及果實品質形成的關系還有待進一步研究。

4 結論

本研究發現，早香柚果實內裂與種子有無及多少密切相關；果實縱向生長緩慢后，果實橫向生長拉力是中心柱開裂的直接原因；異花授粉后，種子不僅具有保護中心柱的物理作用，還可通過激素、多胺等內源物質調控汁胞可溶性糖、有機酸、氨基酸以及莽草酸途徑及其下游次生代謝過程，使果實在外觀和風味性狀上表現明顯的花粉直感效應，其中滲透調節物質的含量變化可能與果實膨大和內裂有關。本研究為異花授粉在柚生產中的合理應用以及進一步研究柚果實內裂調控機制奠定了基礎。