大腸桿菌對藏羊子宮內膜上皮細胞相關炎性因子表達的影響

張興云 王 萌 潘陽陽 胡學權 韓金輝 余四九 徐庚全 王立斌

(甘肅農業大學動物醫學院/甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070)

藏羊是中國綿羊三大品系(蒙古系、藏羊系和哈薩克綿羊系)之一[1-2]，是青藏高原牧民重要的生產和生活資料。但在粗放式的養殖模式下，受大腸桿菌(Escnerichia coli) 和 金 黃 色 葡 萄 球 菌(Staphylococcus aureus)等細菌的感染[3-6]，藏羊子宮內膜炎的發病率水平較高，給當地經濟發展和人民的生活帶來了很大的影響[7]。因此研究藏羊子宮內膜炎發病過程中相關炎性因子的表達規律，對該病的防治具有重要意義。

機體發生炎癥反應時，細胞因子可作為免疫遞質誘導炎癥因子的調節并介導細胞應答過程[8]。白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)作為白細胞系1(interleukin-1，IL-1)的主要分泌形式，在炎癥和自身免疫性疾病的發生和發展過程中發揮著重要的作用，其細胞因子表達水平和機體發生炎癥反應的程度相關，機體的受損程度通常由其表達量的高低反映[9-11]。白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)是炎癥早期產生的促炎細胞因子，組織損傷、劇烈疼痛、應激和炎癥的發生等均可使IL-6 的表達水平升高[12]。白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)屬于趨化因子CXC 基因家族的白細胞趨化因子[13-14]，其能趨化嗜中性粒細胞向感染部位募集，在機體抵抗炎癥中起著重要的作用[15-16]。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)由激活的單核巨噬細胞分泌，它和細胞膜上的特異性的受體結合后發揮促進細胞生長、分化、凋亡及誘發炎癥等重要作用[17-18]。

目前治療子宮內膜炎主要通過抗生素的治療，但大量抗生素的使用導致細菌產生耐藥性，因此如何更有效地防治子宮內膜炎已迫在眉睫。

本研究通過組織塊貼壁法和酶消化法分離培養藏羊子宮內膜上皮細胞(endometrial epithelial cells，EECs)，探索簡便且高效的培養條件，為研究藏羊子宮內膜生殖生理機制提供體外細胞模型；并用不同感染復數(multiplicity of infection，MOI)E.coli感染后，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及酶聯免疫(enyzme linked immunosorbent assay，ELISA)在基因和蛋白水平上檢測IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α等炎性因子在藏羊EECs 上的表達，旨在為揭示子宮內膜炎的發病機理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

細胞培養箱(Forma3110，Thermo Fisher 公司，美國)；熒光倒置相差顯微鏡(CK41，Olympus，日本)；酶標儀(I Mark，Bio-Rad，美 國)；qRT-PCR 儀(Light Cycler 96，羅氏，德國)。

1.2 主要試劑

基礎培養液(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM/F12)(12400-016)、胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)(10099-141)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、青霉素和鏈霉素(15140122)均購自于Gibco 公司(美國)；胰蛋白酶(T4799)、凍存液二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)購自Sigma 公司(美國)；細胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗體、波形蛋白(vimentin)抗體購自Bioss 公司(北京)；標準菌株E.coli(ATCC25922)來自甘肅農業大學動物醫學院；IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α酶聯免疫分析試劑盒(上海晶抗)。

1.3 樣品采集與處理

空懷期健康藏羊子宮取自青海省西寧市某屠宰場，動物屠宰后30 min 內采集樣品，迅速放入含青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，4℃條件下，3 h 內帶回實驗室。

1.4 藏羊EECs 體外分離培養及鑒定

參考并優化馬欣等[19]綿羊子宮內膜上皮細胞的純化培養方法，將樣品沖洗后，剪下子宮角后2/3 段，用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗3 次，剪去子宮阜，將子宮內膜與肌肉組織分離，將子宮內膜剪成1 mm3大小的組織塊備用。

1.4.1 組織塊貼壁法 將組織塊以2 ～3 塊·cm-2的密度接種到直徑3 cm 的培養皿中，每皿加入1 mL 完全培養基DMEM(20%FBS、50 ng·mL-1EGF)，5%CO2，37℃培養6 h，待組織塊貼壁后，再加入1 mL 原代培養基繼續培養，每2 d 換一次培養基，直至細胞鋪滿整個培養皿。

1.4.2 酶消化法 將組織塊用0.2%的膠原酶Ⅰ于37℃水浴震蕩消化；待其變為糊狀時，輕輕吹打，將所得混懸液依次過100、200、400 目細胞篩至3 cm 培養皿中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，分別置于添加50 ng·mL-1EGF 和未添加EGF 的完全培養基DMEM(20%FBS)進行培養。

1.4.3 細胞的純化及傳代 將上皮細胞用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶[含乙二胺四乙酸(thylene amine ttraacetic cid，EDTA)]，37℃消化0.5～1 min，棄去纖維細胞，再加入1 mL 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)，37℃消化2～3 min，鏡下觀察大部分梭形細胞變圓漂浮，此時加完全培養基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加培養基繼續培養。

1.4.4 細胞鑒定 采用細胞免疫熒光方法檢測波形蛋白和角蛋白-18 在待測細胞上的表達，將細胞密度調整至1×104個·mL-1接種于24 孔板培養，待細胞長至80%左右時，棄培養液，PBS 清洗2 ～3 遍；每孔加1 mL 4%多聚甲醛，固定30 min；PBS 振蕩清洗，每孔加250 μL 0.5%TritonX-100，通透20 min；PBS 振蕩清洗，每孔加入250 μL 封閉液1 h，棄廢液，每孔加250 μL 已稀釋(1 ∶100)的一抗，4℃孵育樣品過夜；回收一抗，用PBS 振蕩清洗，每孔加250 μL 已稀釋(1 ∶400)的二抗(山羊抗兔IgG)，37℃避光孵育1 h；PBS 振蕩清洗，每孔加250 μL 4，6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)染核，避光孵育3 min，PBS 清洗后用熒光顯微鏡觀察。免疫熒光方法鑒定細胞時，試驗組一抗為波形蛋白、角蛋白-18，陰性對照組為PBS。

1.4.5 細胞生長曲線 將細胞密度調整至5×103個·mL-1接種到24 孔板，5%CO2、37℃培養，每2 d 換一次培養液；以接種細胞開始記為0 d，每隔24 h 取3孔細胞計數并取平均值，連續計數7 d；以時間為橫坐標，以單位(mL)細胞數為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4.6 細胞的凍存及復蘇 細胞凍存時，調整細胞密度并根據所需加入凍存液，轉入凍存管并封口。先將凍存管放在4℃冰箱30 min，然后轉移至-20℃冰箱放置20 min，再轉入-80℃冰箱過夜。細胞復蘇時，取出凍存細胞并訊速置于37℃恒溫水浴鍋中，加3 ～5 mL 15%FBS 培養液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，調整密度后，5%CO2、37℃培養。

1.5 E.coli 培養及細胞感染試驗

1.5.1E.coli的培養E.coli采用劃線法接種至固體培養基，37℃恒溫培養16～24 h；待菌株形成單個菌落，挑取單個菌落接種至1 mL LB(luria-bertani)液體培養基，置于恒溫振蕩器，37℃震蕩培養24 h，得到菌懸液；通過活菌計數法對其計數后置于4℃備用。

1.5.2E.coli感染試驗 將細胞調整密度后接種在6 孔板，5%CO2、37℃培養至對數生長期，PBS 清洗后取3 孔計數并取平均值；設置不同的MOI 進行E.coli感染試驗，即設空白對照(正常培養的細胞，CK)、1 ∶1、5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1、50 ∶1共6 組試驗模型(MOI 為細菌數∶細胞數)，每孔各加2 mL 基礎培養液，并按所設MOI加入相應體積E.coli；37℃感染培養3 h，觀察并拍照。

1.6 細胞總RNA 提取及反轉錄

提取感染細胞總RNA，并反轉錄成cDNA；反應體系(20 μL):6 μL ddH2O，2 μL 5×gDNA digester Buffer，1 μL gDNA digester，1 μL 模板RNA，42℃孵育2 min，再加10 μL 2×Honor? ⅡSuperMix plus。反應條件:25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存。

1.7 引物設計

在GenBank 數據庫中檢索羊IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和β-actin基因序列，用Primer Premier 6.0 軟件設計引物，由上海生工基因公司合成，引物序列見表1。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the test

1.8 qRT-PCR 檢測IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的基因表達

通過qRT-PCR 檢測IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的基因表達，β-actin為內參基因，反應體系(20 μL):TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，cDNA 模板2 μL。反應條件:95℃預變性5 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個循環，每個樣品設4 個重復組，試驗重復3次。通過2-ΔΔCt方法計算上述基因的相對表達量。使用SPSS 25 軟件對數據進行分析。

1.9 ELISA 檢測IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的蛋白表達

E.coli感染藏羊EECs 3 h 后將6 孔板上清液保存至1.5 mL 無菌離心管中，并通過ELISA 測定細胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的蛋白表達。

2 結果與分析

2.1 細胞體外分離培養及鑒定

2.1.1 組織塊貼壁法 組織塊培養到第7 天時周圍已有細胞長出，主要有2 種細胞，分別是纖維細胞和上皮樣細胞(圖1-A)；再經過1 ～2 d 的培養，細胞逐漸融合在一起，單層鋪滿組織周圍(圖1-B)，此時PBS清洗后可將細胞用0.25%胰蛋白酶進行純化，去除大部分纖維細胞以及部分上皮樣組織塊；繼續培養1 ～2 d 后細胞長到培養皿面積的80%以上(圖1-C)，根據細胞生長情況重復純化過程，可將纖維細胞及上皮樣組織塊逐步去除干凈，可得到純度較高的藏羊EECs(圖1-D)。

2.1.2 酶消化法 經過12 h 培養后無EGF 組上皮樣細胞貼壁較少，而EGF 組上皮樣細胞已大量貼壁，兩組上皮樣細胞均簇擁在一起(圖2-A、圖3-A)，同時發現少量成纖維細胞；此時給兩組細胞更換培養液培養24 h，細胞即可鋪滿培養瓶底部(圖2-B、圖3-B)，但EGF 組細胞明顯更密集；PBS 清洗后可將兩組細胞用0.25%胰蛋白酶利用差速消化法進行純化，此時將完全培養基濃度由20%FBS 降至15%FBS，其余條件不變，培養48 h 后(第2 代)，無EGF 組細胞形態規則較亂(圖2-C)，而EGF 組細胞形態規則且長勢良好(圖3-C)；根據細胞生長情況重復兩組細胞純化培養過程，可將EGF 組成纖維細胞逐步去除干凈，得到純度較高的藏羊EECs(圖3-D、E)，并可傳至6 代以上(圖3-G)，無EGF 組細胞則從第3 代開始細胞長勢及活性快速下降，純度也開始降低，細胞體積變大，細胞量減少(圖2-D)。

2.1.3 EECs 的鑒定 細胞免疫熒光方法檢測顯示，PBS(陰性對照)、波形蛋白在上皮細胞質上不表達，呈陰性(圖4-A2、A3、B2、B3)，角蛋白-18 在上皮細胞中特異性表達，細胞質被染成紅色，呈陽性(圖4-C2)，鑒定顯示，僅有極少成纖維細胞出現，藏羊EECs 純度達98%以上。

圖1 組織塊貼壁法獲得的藏羊EECsFig.1 Tibetan sheep EECs cultured by tissue explants adherent method

圖2 酶消化法獲得的藏羊EECs(無EGF)Fig.2 Tibetan sheep EECs cultured by enzymatic digestion (without EGF)

圖3 酶消化法獲得的藏羊EECs(含EGF)Fig.3 Tibetan sheep EECs cultured by enzymatic digestion (with EGF)

2.1.4 細胞的生長曲線 接種細胞后，第1 天時細胞微量增殖，速度較慢，處于停滯期；第2 天時，細胞增殖較明顯；第3 天開始細胞增殖極為旺盛，處于對數生長期；第5 天時，細胞增殖達到最高值，細胞不再增殖，隨后進入平臺期。根據所得曲線，藏羊EECs 的生長曲線似“S”形(圖5)。

2.2 E.coli 感染藏羊EECs

經活菌計數測得E.coli濃度為7×108CFU·mL-1，細胞計數法得到6 孔板單孔平均細胞數為3.6×105個；顯微鏡觀察發現，空白組細胞狀態良好；當MOI 為1 ∶1時，僅有少量E.coli附著在細胞表面，出現空泡樣，細胞正常生長(圖6-A、B)；當MOI 為5 ∶1和10 ∶1時，細胞開始脫落且能明顯看到E.coli附著在細胞表面，此時大部分細胞也可正常生長(圖6-C、D)；當MOI 為20 ∶1和50 ∶1時，細胞上附著有大量E.coli，并出現大量細胞碎片，只有少量細胞能正常生長(圖6-E、F)。

2.3 qRT-PCR 檢測IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的基因表達情況

由圖7、8 可知，E.coli感染藏羊EECs 3 h 后，與CK 相比，當MOI 為1 ∶1時，IL-1β、IL-6 和IL-8 基因的相對表達量升高，但不顯著，TNF-α基因的相對表達量達到最高且差異顯著；隨著MOI 增加，除TNF-α基因外，其余各基因的相對表達量均逐漸增加，當MOI為20 ∶1時，IL-8 基因的相對表達量達到最高；當MOI為50 ∶1時，IL-1β、IL-6 基因的相對表達量達到最高，而TNF-α基因的相對表達量較CK 升高不顯著。

圖4 藏羊EECs 免疫熒光鑒定Fig.4 Immunofluorescence identification of Tibetan sheep EECs

圖5 藏羊EECs 生長曲線Fig.5 Growth curve of Tibetan sheep EECs

2.4 ELISA 檢測IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的蛋白表達情況

由圖9、10 可知，IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α在蛋白合成過程中與其基因的相對表達量趨勢一致，即E.coli感染藏羊EECs 3 h 后，當MOI 為1 ∶1 時，IL-1β、IL-6 和IL-8 的蛋白含量與CK 相比較變化不明顯，但TNF-α的蛋白含量達到最高；隨著MOI 增加，除TNF-α外，其余各基因的蛋白含量逐步增加，當MOI 為20 ∶1時，IL-8 的蛋白含量達到最高；當MOI 為50 ∶1時，IL-1β、IL-6 的蛋白含量達到最高，而TNF-α基因的蛋白含量變化不顯著。

3 討論

3.1 藏羊EECs 體外分離培養

圖6 不同MOI 下藏羊EECs 的形態變化Fig.6 Morphological changes of Tibetan sheep EECs at different MOI

圖7 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-1β、IL-6 基因的相對表達Fig.7 Relative expression of IL-1β and IL-6 gene in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

圖8 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-8、TNF-α 基因的相對表達Fig.8 Relative dxpression of IL-8 and TNF-α gene in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

圖9 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-1β、IL-6 的蛋白表達Fig.9 Protein expression of IL-1β and IL-6 in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

圖10 E.coli 感染藏羊EECs 后IL-8、TNF-α 的蛋白表達Fig.10 Protein expression of IL-8 and TNF-α in Tibetan sheep EECs infected with E.coli

研究表明，EGF 對細胞生長的影響具有物種差異性和劑量依賴性[20-23]，低劑量EGF 可促進增殖，而高劑量EGF 可誘導細胞周期停滯和凋亡[24]。本試驗通過組織塊貼壁及酶消化2 種方法對藏羊EECs 進行體外培養，并在酶消化法培養過程中設置了加入低劑量(50 ng·mL-1)的EGF 組和無EGF 組。何志全等[25]、陳利平等[26]在組織塊貼壁法培養過程中用刀刮取子宮內膜上皮組織使其呈糊狀后再進行培養，但是用刀刮取過程對上皮組織造成巨大損傷，致使細胞活力降低且不易存活。趙誠悅等[27]發現組織塊貼壁法獲得的細胞基質細胞占據主導優勢，但無法對細胞進行純化。馬欣等[19]成功通過組織塊貼壁法獲得較高純度的綿羊子宮內膜上皮細胞，但此方法獲得的細胞需經過5～7 次的純化，該細胞在經過3～4 次傳代后細胞出現形態變化，如體積變大、內部出現空泡，活性降低，表現為不易消化、貼壁情況不佳以及生長緩慢等。本試驗采用改良的組織塊培養法，在培養液中加入50 ng·mL-1EGF，可顯著促進上皮細胞的優勢生長，用0.25%胰蛋白酶進行2 ～3 次消化去除基質細胞可得到較高純度的EECs，從第4 代細胞開始細胞體積變大，活性逐漸下降，這可能與胰蛋白酶的長時間作用有關。王偉[28]用0.25%膠原酶Ⅰ在37℃水浴消化奶牛子宮上皮組織3 ～4 h，得到純度98%的EECs；馬欣等[19]用0.1%膠原酶Ⅰ在37℃消化綿羊子宮上皮組織6 h，得到純度70%的EECs。本試驗采用0.2%膠原酶Ⅰ37℃震蕩水浴消化6 h，依次過100、200、400 目細胞篩后可得到所需的EECs；同時用完全培養基反沖400 目細胞過濾篩后可得到純度較高的EECs。為驗證不同條件下上皮細胞的生長情況，本試驗設置了無EGF 組和EGF 組，從原代細胞開始，EGF 組表現出更好的生長狀態，細胞用0.25%胰蛋白酶利用差速消化法進行純化，只需30 s 即可去除成纖維細胞、90 ～120 s 可使所有細胞變圓漂浮，培養時貼壁情況也較好，可在3～4 次將成纖維細胞以及其他雜細胞快速去除干凈，經鑒定可獲得純度98%以上的EECs；而無EGF 組細胞則從第3 代開始細胞長勢及活性快速下降，純度也開始降低，細胞體積逐漸變大，細胞量逐步減少。EGF 組獲得的細胞可傳至6 代以上，可用于后續試驗，這也為構建藏羊子宮內膜體外模型奠定了基礎。

3.2 IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達

研究發現，發生子宮內膜炎時，病原微生物入侵子宮腔，對子宮內膜的上皮屏障造成破壞，子宮內膜的組織結構發生相應變化，同時能夠引起子宮組織對炎癥細胞因子表達的變化[29]。IL-1β[10]、IL-6[12，30]、IL-8[15，31-33]、TNF-α[20]等作為炎性因子，在炎癥反應中有著極其重要的作用，炎性因子表達水平的升高或降低與機體發生炎癥反應的程度存在相互協同的關系，其表達量的高低決定了機體受損的程度。Loyi 等[34]研究發現，患子宮內膜炎的奶牛子宮組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達集體上調。Ghasemi 等[35]研究發現，在確診為子宮內膜炎的奶牛子宮組織中IL-6 的表達上調約30 倍，TNF-α的表達上調約20 倍。王偉[28]在體外通過不同濃度E.coli以及S.aureus感染奶牛子宮內膜上皮細胞并建立奶牛子宮內膜炎病理模型后發現，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 的表達量也呈現上升趨勢。鄭強強[29]研究發現，在山羊子宮內注入E.coli后，TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達量迅速上升，且對山羊子宮形成急性感染。在本試驗中，經E.coli感染藏羊EECs 3 h 后，也能成功建立體外子宮內膜炎病例模型，隨著MOI 的逐漸增加，細胞結構逐步遭到破壞，直至細胞大量死亡脫落。IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α基因的mRNA 表達量與蛋白的表達量趨勢基本一致，與上述研究結果相似，但當MOI 為1 ∶1時，TNF-α表達量顯著提高，而MOI 為50 ∶1時卻提高不顯著，與其他因子的表達量不一致，有待進一步研究。接種E.coli不僅能夠引起藏羊EECs 的局部感染以及形態變化，同時也能夠引起藏羊EECs 對炎癥細胞因子在基因和蛋白水平上表達的變化。因此，上述各炎癥因子可作為識別藏羊子宮內膜炎病理程度的重要指標。

4 結論

本研究發現在培養液中加入50 ng·mL-1EGF 后成功用組織塊貼壁法及酶消化法分離培養出藏羊EECs，且只有添加EGF 的酶消化法培養的藏羊EECs可正常傳代，通過波形蛋白及角蛋白-18 免疫熒光鑒定，藏羊EECs 純度達到98%以上，這為研究藏羊子宮內膜生殖生理機制提供了體外細胞模型。不同MOIE.coli感染下藏羊EECs 結構逐漸遭到破壞，MOI 越大，細胞壞死越嚴重。同時IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α基因和蛋白表達量均較空白對照組明顯升高。本研究結果為識別藏羊子宮內膜炎病理程度提供了參考指標。