武夷紅櫻分類地位的修訂

王志龍 付 濤 林 立 林樂靜 李 文 劉 峰 朱文欣 陳際伸

(寧波城市職業技術學院/浙江園林綠化應用技術協同創新中心，浙江 寧波 315100)

櫻屬(PrunusL.)植物隸屬薔薇科(Rosaceae)，全世界約150 種，我國約50 種，居世界各國之首。野生櫻屬植物遍布我國各地，資源豐富，其表型具有較強的可塑性，種間雜交普遍，種間模糊，種內變異較大；此外，氣候條件等環境因素差異巨大，導致變異幅度大，在資源分類中極易存在混亂與爭議[1-2]。如山櫻(P.serrulata)花廣泛分布于我國大部分地區，日本和朝鮮也有分布，不同地區其各部分性狀變異非常大；華中櫻(P.conradinae)分布廣泛且各部分性狀變異也很大，如萼筒、總梗長短以及花序傘形或近傘形花序常因地理環境不同而變化；鐘花櫻(P.campanulata)主要分布于我國東南沿海省份。日本無野生種分布，并將其進行引種繁殖。目前，日本許多優良品種如寒櫻(P.campanulataKanzakura)、修善寺寒櫻(P.campanulataRubescens)、河津櫻(P.campanulataKawazu-zakura)、陽光櫻(P.campanulataYoukou)等紅色花系櫻花的親本均為鐘花櫻。然而，鐘花櫻與高盆櫻(P.cerasoides)近似，一些學者主張將其作為高盆櫻的變種，其分類地位尚不清晰；紅山櫻(P.jamasakura)與山櫻花接近，也常被定義為一個種。由于許多野生櫻屬植物種間模糊，界限不清晰，存在著許多過度類型，而種內又存在著較大差異，這給我國野生櫻屬植物的分類帶來了極大困難，許多已經命名的物種其分類地位仍有待考證。2003年《Flora of China》第九卷出版，對之前發表的新種作了相應處理，如將垂枝毛櫻桃歸入毛櫻桃(P.tomentosa)，將泰山野櫻花歸入山櫻等[3]。最近十年，又有新種(變種) 不斷被發現，如武夷紅櫻(P.campanulatavar.Wuyiensis)[4]、磐安櫻(P.pananensis)[5]、雪落櫻(P.xueluoensis)[6]、沼生矮櫻(P.jingningensis)[7]等。

武夷紅櫻是2007年王賢榮等[4]和伊賢貴[8]在福建武夷山調查時發現的，因其外形與鐘花櫻形態相似而被定義為鐘花櫻變種，武夷紅櫻與鐘花櫻相比，盛開時花朵完全展開，花色十分艷麗。目前，武夷紅櫻僅見于福建武夷山地區，其資源極其珍貴，觀賞價值極高，具有巨大市場價值。

對于已承認的以及新發現的或有爭議的種(變種)大多根據形態學分類所得出的結論判斷，但植物的表型是自身遺傳物質和所處環境共同作用的結果。同一物種所處的環境不同，其生態型也不同，往往表現為趨異進化；而不同物種處于相同的環境條件下，其種間往往表現出趨同進化的特征。因此，單純以形態的差異或變異作為鑒定物種的標準，常出現偏差甚至錯誤。武夷紅櫻為我國分布特有種，其遺傳背景的研究對今后的資源保護和育種工作都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年3-4月櫻花育種課題組成員先后從福建(117°24′～118°02′E，27°32′～27°55′N)、云南(25°N、102°E)、上海(121°.4′E、31°.2′N)、浙江(120°55′～122°16′E、28°51′～30°33′N)等地搜集了16 份櫻花種質資源(表1)，采其健康、無病害的幼葉用于試驗。

表1 16 份櫻屬植物樣品信息及其來源Table 1 Sixteen samples information and source of Cerasus plants

1.2 SSR 擴增

利用試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)提取16 份材料的DNA，采用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，Bio-Photometr 核酸檢測儀(德國Eppendorf 公司)檢測DNA 濃度和純度，再根據計算所得的DNA 濃度，將DNA 樣品溶液用溫熱的Tris-EDTA(TE)稀釋成50 ng·μL-1，-20℃保存備用。PCR 反應體系與擴增程序參考付濤等[9]、吳月燕等[10]的方法。其中12 對引物序列由上海生工生物公司合成，引物信息見表2。

1.3 DNA 條形碼

PCR 反應體系參考付濤等[9]的方法。選擇4 個葉綠體間隔區序列trnH-psbA、rpl32-trnL、psbJ-petA和trnLtrnF作為鑒別序列(rbcL和matK片段在種水平上鑒別率較低，故未使用)，其引物序列見表3。trnH-psbA、rpl32-trnL、psbJ-petA和trnL-trnF的擴增程序均為:94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環；最后72℃延伸10 min。PCR 產物送上海桑尼生物科技有限公司進行雙向測序。

1.4 數據分析

簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)分子標記數據與DNA 條形碼數據處理:參考付濤等[9]和吳月燕等[10]的數據處理方法。

2 結果與分析

2.1 聚類分析

根據SSR 擴增結果(圖1)，利用NTSYSpc2.10e 軟件進行Jaccard 相似性系數分析，計算不同物種間遺傳相似系數，其范圍在0.653 1～0.918 4 之間(表4)。

表2 12 對引物的堿基序列及其相關信息Table 2 Base sequences and related information of twelve pairs of primers

表3 DNA 條形碼引物名稱及其序列Table 3 Primer names and sequences of DNA barcoding

由遺傳相似系數進行UPGMA 聚類分析，構建了16 份櫻屬植物的聚類關系圖(圖2)。結果表明，首先，野生早櫻、浙閩櫻、尾葉櫻與黑櫻桃被聚為一類；其次，武夷紅櫻、高盆櫻、華中櫻與鐘花櫻被聚為一類；再次，山櫻、郁李、毛櫻桃、雪落櫻與沼生矮櫻被聚為一類；最后，散毛櫻、崖櫻桃與迎春櫻單獨聚類。

聚類結果表明，武夷紅櫻與華中櫻親緣關系最近(武夷山地區無高盆櫻分布)，推測武夷紅櫻遺傳背景較為復雜，可能為鐘花櫻與華中櫻的雜交種，或為華中櫻的變種等。

圖1 引物M6a 的SSR 擴增圖Fig.1 SSR amplification using the M6a primer

表4 16 份櫻屬植物SSR 分析的遺傳相似系數Table 4 Genetic similarity coefficient of 16 samples of Cerasus plants based on SSR analysis

圖2 基于SSR 構建的16 份櫻屬植物的UPGMA 聚類分析Fig.2 UPGMA dendrogram of the sixteen samples of Cerasus plants based on SSR

2.2 武夷紅櫻、鐘花櫻和華中櫻形態特征比較

為了進一步鑒定和確認武夷紅櫻的分類地位，對武夷紅櫻、鐘花櫻與華中櫻的樹枝、花、葉片和果實形態特征進行了比較。比較樹皮、小枝和嫩枝等樹枝的主要特征發現，武夷紅櫻與華中櫻樹干顏色一致，均為灰褐色；小枝顏色和嫩枝顏色三者大體一致，為褐色和紫紅色；武夷紅櫻嫩枝有較多絨毛，而鐘花櫻與華中櫻光滑無毛(表7)。比較花柄、苞片、萼筒、萼片、花柱、雄蕊數目和花色等花的主要特征發現(表6)，鐘花櫻和武夷紅櫻在花柄的總梗、花梗長度和雄蕊數目等數量性狀上差異較小且變異相對較小，而華中櫻變異范圍較大。此外，在一些質量性狀上華中櫻變異也極大，如華中櫻花序呈傘形或傘形總狀(鐘花櫻傘形，武夷紅櫻傘形總狀)，萼片直立或反轉(鐘花櫻直立，武夷紅櫻反轉明顯)，花色為白色乃至粉紅色(鐘花櫻深紅色，武夷紅櫻紅色)；在花柄絨毛、萼片形狀以及苞片顏色和形狀等質量性狀上，武夷紅櫻與鐘花櫻、華中櫻之間均有明顯差異，如武夷紅櫻花柄披絨毛，而鐘花櫻、華中櫻無或極少；在花柱和萼筒性狀上，三者幾乎無明顯差異。通過比較葉片形態特征發現(表7)，武夷紅櫻與鐘花櫻在幼葉顏色，成齡葉形狀、尖端類型、基部形狀、主脈顏色、葉柄顏色、托葉形狀上幾乎無差異，而與華中櫻差異較大。但武夷紅櫻在成齡葉鋸齒情況、正反面有無絨毛以及葉柄有無絨毛與鐘花櫻和華中櫻差異較大。通過比較果實的主要特征發現(表8)，三者果實顏色差異較大，武夷紅櫻果實黑色，而鐘花櫻和華中櫻果實為紅色；此外，武夷紅櫻與鐘花櫻的果實形狀、果梗長以及種子表面棱紋特征幾乎無明顯差異，但與華中櫻差異較大。通過對樹枝、花、葉片和果實等形態特征的綜合比較，武夷紅櫻與鐘花櫻形態上更為接近，結合SSR 分析結果認為，武夷紅櫻可能為鐘花櫻與華中櫻的雜交種。

表5 武夷紅櫻、鐘花櫻和華中櫻樹枝的形態特征比較Table 5 Comparison of morphological characteristics of branches in P.campanulata var. Wuyiensis， P.campanulata and P.conradinae

表6 武夷紅櫻、鐘花櫻和華中櫻花的形態特征比較Table 6 Comparison of morphological characteristics of flowers in P.campanulata var.Wuyiensis， P.campanulata and P.conradinae

2.3 武夷紅櫻、鐘花櫻和華中櫻的DNA 條形碼分析

為了進一步驗證試驗結果，采用DNA 條形碼技術對武夷紅櫻(P.campanulatavar.Wuyiensis1 andP.campanulatavar.Wuyiensis2，以下簡稱PcW1 和PcW2，分別為武夷紅櫻不同單株)、鐘花櫻和華中櫻進行分析。測序結果經過DNAMAN 處理后，獲得完整的基因序列或序列長度一致的基因序列(完整基因的一部分) 用于后續分析。通過MEGA 的Sequence Data Explorer 功能比對序列信息(圖3)，發現武夷紅櫻(PcW1 和CcW2)與華中櫻的葉綠體trnH-psbA間隔區序列完全一致，而比鐘花櫻多1 條含18 個堿基的序列(TTTATCATTACTTGTAAG)(圖3-A)；武夷紅櫻與華中櫻的葉綠體rpl32-trnL間隔區序列含有1 條20 個堿基的序列(AATTATATATTATTATATAT)，而武夷紅櫻與華中櫻的葉綠體rpl32-trnL間隔區序列完全一致。此外，PcW1 和PcW2 與鐘花櫻均有3 個位點差異，以及含1條60 個堿基的序列(TTATAATTATATATTAAAAATAT TATAATTATATATTAAAAGATATTATAATTATATATT)(圖3-B)；武夷紅櫻(PcW1 和PcW2)與華中櫻的葉綠體petA-psbJ間隔區序列有1 個堿基位點差異，以及缺失1 條24 個堿基的序列(TCTGTTACTCACATCTGTTA CTCA)，而與鐘花櫻有5 個位點差異(圖3-C)；武夷紅櫻(PcW1 和PcW2)與華中櫻的葉綠體trnL-trnF間隔區序列有3 個位點差異，而與鐘花櫻有75(77)個位點差異，差異較大(圖3-D)。

表7 武夷紅櫻、鐘花櫻和華中櫻葉片的形態特征比較Table 7 Comparison of morphological characteristics of leaves in P.campanulata var.Wuyiensis， P.campanulata and P.conradinae

表8 武夷紅櫻、鐘花櫻和華中櫻果實的形態特征比較Table 8 Comparison of morphological characteristics of fruits in P.campanulata var.Wuyiensis， P.campanulata and P.conradinae

運用MEGA 4.0 軟件，基于K2-P 距離模型進行trnH-psbA＋rpl32-trnL＋petA-psbJ＋trnL-trnF序列的進化樹構建(圖4)，結果顯示，武夷紅櫻(PcW1 和CcW2)與華中櫻聚為一類，而與鐘花櫻相距較遠，這與SSR 結果相一致，均表明武夷紅櫻與華中櫻在基因水平上相似度更高，加之葉綠體基因呈母系遺傳的特點，再結合形態特征，說明武夷紅櫻為鐘花櫻(父本)與華中櫻(母本)的雜交種。

3 討論

SSR 分子標記技術已廣泛應用于物種分類系統比較、種質鑒定、指紋圖譜構建、輔助育種等方面，目前分子標記技術也廣泛應用于櫻屬植物的相關研究[16-17]。如趙慶杰等[18]利用特征序列擴增區域(sequence characterized amplified regions，SCAR)分子標記技術鑒定了櫻花品種；宗宇等[19]開發了中國櫻桃轉錄組的SSR 分子標記及鑒定研究；何恒流等[20]利用SSR 分子技術分析了陜西7 個毛櫻桃自然居群的遺傳多樣性；陳潔[21]利用SSR 技術分析了山櫻花居群的遺傳多樣性；Cantini 等[22]用桃、甜櫻桃和酸櫻桃的10 對SSR 引物繪制了59 份四倍體酸櫻桃種質資源指紋圖譜；張琪靜等[23]利用SSR 分子技術對相關櫻桃品種進行了遺傳多樣性分析，并開發了甜櫻桃的指紋檢索系統；李苗苗[24]利用葉綠體微衛星(chloroplast microsatellite，cpSSR)與簡單重復序列間擴增(inter-simple sequence repeat，ISSR)分子標記技術分別對我國櫻屬植物和中國櫻桃進行了地理親緣關系以及遺傳結構和多樣性的研究。本研究前期利用ISSR 分子標記技術對39 個日本櫻花品種進行了聚類分析，探討了彼此間的親緣關系，并將其分為7 組，與前人研究結果一致，表明ISSR比較適用于櫻花的品種分類[25]。本研究通過SSR 技術對16 種櫻屬植物進行了聚類分析，探討了彼此間的親緣關系，結果表明絕大部分與形態分類相一致，說明SSR 分子標記技術適合櫻屬種水平的親緣關系分析，但武夷紅櫻并未與原種鐘花櫻聚為一類，而與華中櫻聚為一類，因此，初步判定武夷紅櫻并不是由鐘花櫻單獨一個種進化而來，可能還攜帶有其他近緣種的“血統”，如華中櫻。然而形態上武夷紅櫻與鐘花櫻更為接近，因此，武夷紅櫻的分類地位有待商榷。在相同材料下，引物越多、擴增位點越豐富、多態性越高，得到的聚類結果越準確。本研究僅采用12 對引物對16 份材料進行了擴增，且大部分標記為EST-SSR 標記，擴增位點相對較少，多態性指數相對偏低，可能導致試驗存在較大誤差，不能充分反映物種間真實的親緣關系，或者得到明顯有悖于形態學分類的結果，因此，后續試驗還需加大引物數量，最好將EST-SSR 和gSSR 進行混合搭配，可較為準確地對櫻亞屬植物進行鑒別與分類。

圖3 trnH-psbA、rpl32-trnL、petA-psbJ 和trnL-trnF 的序列對比圖Fig.3 Sequence comparison on trnH-psbA， rpl32-trnL， petA-psbJ and trnL-trnF

圖4 基于trnH-psbA+rpl32-trnL+ petA-psbJ+trnL-trnF 序列構建的進化樹Fig.4 Neighbor-joining tree based on trnH-psbA+rpl32-trnL+ petA-psbJ+trnL-trnF sequences

DNA 條形碼已逐漸應用于新種或隱存種的發現、分類學修訂以及資源利用等方面[26]。目前，植物DNA 條形碼的研究主要集中于葉綠體基因組和核基因組，已在不同科、屬、種中廣泛應用[27]。葉綠體基因組具有呈單親遺傳且進化速率較快等特點，是篩選植物DNA 條形碼的重要區域之一。此外，通過比較雜交后代與親本的葉綠體基因序列的差異，可以確定雜交后代親本類型，如Ohta 等[28]通過rpl16-rpl14 序列標記認為大葉早櫻為日本櫻花的母本。本試驗通過4 個葉綠體基因序列(trnH-psbA＋rpl32-trnL＋petA-psbJ＋trnLtrnF)對武夷紅櫻、鐘花櫻與華中櫻進行對比發現，武夷紅櫻與華中櫻的trnH-psbA和rpl32-trnL序列完全一致，而與鐘花櫻均有不同程度的差異；此外，武夷紅櫻與華中櫻的petA-psbJ和trnL-trnF序列差異也明顯小于與鐘花櫻之間的差異，尤其是trnL-trnF序列，武夷紅櫻與華中櫻僅有3 個位點差異，而與鐘花櫻卻有75(77)個位點差異，因此，推薦trnL-trnF序列作為鑒定武夷紅櫻與鐘花櫻的標準條形碼序列。基于組合序列構建的進化樹表明，武夷紅櫻與華中櫻聚為一類，而與鐘花櫻相聚較遠，再結合SSR 和形態觀測結果，確定武夷紅櫻為華中櫻與鐘花櫻的自然雜交種，由于葉綠體基因呈母系遺傳，因此，確定華中櫻為母本，鐘花櫻為父本。

形態學分類有其固有缺陷，如比較依賴齊全的標本等；單純依賴分子手段也容易出現明顯違背形態學分類的結果，主要是因為并非所有堿基的變化都會引起植物性狀的差異，因此，形態學結合分子手段才能較為準確地對一個物種的分類地位進行準確劃分[29-31]。本研究利用SSR 分子標記與DNA 條形碼技術等分子生物學和遺傳學知識并結合形態觀測的方法，確立了武夷紅櫻的親本，由于武夷紅櫻在基因水平上與華中櫻更為接近，但形態上卻與鐘花櫻更為相似，因此，建議將武夷紅櫻升級為介于鐘花櫻與華中櫻之間的一個獨立的種。

4 結論

本研究通過SSR 分子標記技術對16 個櫻屬種進行聚類分析，發現武夷紅櫻與華中櫻親緣關系更近，而與鐘花櫻關系較遠，推測鐘花櫻和華中櫻可能與武夷紅櫻有父母本關系，或武夷紅櫻為華中櫻的變種。形態觀測表明武夷紅櫻與鐘花櫻形態上更為接近。最后通過4 個葉綠體基因序列(trnH-psbA、rpl32-trnL、petApsbJ和trnL-trnF)比對分析表明武夷紅櫻與華中櫻序列一致性較高，最終得出武夷紅櫻為鐘花櫻與華中櫻的自然雜交種，其父本為鐘花櫻，母本為華中櫻。