消化道上皮單羧酸轉運蛋白1(MCT1)跨膜轉運功能的調控機理

董賢文 付 琳 張 麗 周 鵬 任航行 王高富

(重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

消化道具備良好的營養物質吸收功能是家畜高效養殖的重要基礎。營養物質主要以自由擴散、主動轉運和胞飲作用等方式通過消化道壁，而后進入血液和淋巴循環系統供機體利用。

碳水化合物是動物日糧的重要營養物質，其含量達總營養成分數量的一半以上[1]。大部分碳水化合物在單胃動物后腸和反芻動物瘤胃中經微生物發酵產生大量單羧酸(含有2～4 個碳原子和1 個羰基端的有機酸)供機體利用，如揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFAs)、β-羥基丁酸、乙酰乙酸和乳酸等[2]。其中VFAs 作為重要的能量物質，可為單胃動物提供15%～20%的能量，為反芻動物提供75%的能量[3]。此外，單羧酸還具有促進消化道上皮細胞分化與增殖，抗炎癥以及參與營養代謝調控等生理作用[3-5]。

單羧酸發揮上述生理作用的首要前提是經轉運進入循環系統。由于消化道上皮腔面存在鈉氫交換蛋白，細胞中的H＋被泵出形成低pH 環境，單羧酸在此處主要以未解離形式存在，未解離的單羧酸多通過自由擴散進入消化道上皮細胞，少部分通過主動轉運進入[6]。由于消化道上皮細胞細胞質pH 為中性，單羧酸解離為H＋和陰離子難以通過自由擴散穿過細胞壁，細胞質中單羧酸主要通過單羧酸轉運載體MCT1(monocarboxylate transporter，MCT1)以主動轉運方式進入血液[7-8]。因此，MCT1 作為單羧酸的轉運載體，在單羧酸從細胞質外排進入血液進而行使生物學功能的過程中起到十分關鍵的作用[9-10]。基于此，本文重點對MCT1 的結構及功能特點、在動物消化道上皮的表達分布特點、轉運吸收過程及其調控機理進行綜述。以期為MTC1 的功能調控研究提供參考。

1 MCT1 基因與蛋白結構

MCT 家族是哺乳動物細胞膜上一類重要的跨膜轉運蛋白。目前MCT 家族已發現14 個成員，其中僅有MCT1～4 亞型具有離子的轉運功能。4 種亞型間具有底物差異性和組織分布特異性，其他成員可介導激素、氨基酸、小肽等物質的跨膜轉運。MCT1 是最早被發現的MCT 家族成員，1992年Poole 等[11]在小鼠紅細胞膜上發現了一種參與乳酸吸收的轉運蛋白，進一步研究了該轉運蛋白的底物、動力學等特性以及抑制劑篩選。1994年Garcia 等[12]首次在倉鼠和人類中提取純化得到該轉運蛋白，并正式命名為MCT1，其中人類MCT1 基因位于1 號染色體短臂的13 區帶附近，長度約44 kb，由5 個外顯子和4 個內含子組成[13]。MCT1 基因含有基因啟動子刺激蛋白(specificy protein，SP1)、活化因子蛋白(activity protein，AP1)、NF-κB 等轉錄因子的結合位點，其編碼蛋白含有約500 個氨基酸[13]。在家畜動物研究上，Ritzhaupt 等[14]研究了豬結腸中MCT1 的基因、蛋白表達以及吸收轉運特點，發現豬MCT1 基因核苷酸序列與人的同源性為92%。Kirat 等[15]研究了MCT1 在小牛消化道中MCT1 的表達分布與功能特點，發現牛MCT1 基因核苷酸序列與人的同源性為86%，蛋白質氨基酸序列與人的同源性為88%。MCT1 基因在各物種中的序列同源性較高，說明其進化中功能具有保守性。

蛋白水解研究結果表明，MCT1 的二級結構由位于細胞質內的N-端、C-端和12 個跨膜螺旋結構域(transmembrane domain，TM)組成，其中TM 片段6 ～7之間有一個大的細胞內環(圖1)。MCT1 的三維結構存在閉合(暴露細胞質底物結合位點)和開放(暴露細胞外底物結合位點)兩種構象(圖2)。第38 位點的賴氨酸殘基位于通道蛋白中央，研究認為其對MCT1 物質轉運起關鍵作用[17]。

圖1 MCT1 蛋白二級結構[16]Fig.1 The secondary structure of MCT1 protein[16]

圖2 MCT1 蛋白3D 結構[16]Fig.2 The 3D structure of MCT1 protein[16]

2 MCT1 在消化道的分布特點和定位

2.1 MCT1 在消化道的分布特點

MCT1 在消化道、大腦、肝臟、腎臟和肌肉等多種組織中廣泛表達，其中消化道是MCT1 高表達組織之一。研究表明MCT1 在胃腸道各段均有表達(圖3)，但存在明顯的時空分布差異[15]。MCT1 在犢牛整個消化道均表達，其在空腸和回腸中的表達量最高，顯著高于結腸和直腸的表達量，在十二指腸表達量最低[18]。MCT1 mRNA 在豬大腸中的表達量比小腸高20 余倍，MCT1 蛋白在十二指腸、空腸、回腸中表達量極低，這與大腸是單胃動物消化道微生物發酵的主要場所有關[19]。成年反芻動物消化道中前胃MCT1 表達量高于后腸，且前胃中瘤胃的MCT1 表達量最高。Kirat等[16]研究發現山羊MCT1 蛋白表達量由高到低依次為瘤胃、網胃、瓣胃、盲腸、結腸、皺胃和小腸。瘤胃中以瘤胃腹囊MCT1 表達量最高，其次是瘤胃前庭、后背盲囊、瘤胃背囊[20]。瘤胃、網胃和瓣胃上皮屬于復層扁平上皮，由4 層種類和功能不同的細胞組成，由瘤胃上皮頂端向基地側依次為角質層、顆粒層、棘狀層和基底層；角質層由死亡的角質化細胞組成，顆粒層含有緊密連接蛋白，棘狀層和基底層分布有線粒體，可將VFAs 代謝成酮體[21]。Graham 等[22]研究發現MCT1主要分布在成年反芻動物瘤胃、網胃、瓣胃的棘狀層和基底層細胞中。消化道上皮細胞屬于極性細胞，細胞膜由緊密連接蛋白分為頂端膜和基底側膜，二者膜蛋白的種類和組成具有顯著差異。研究發現MCT1 在單層柱狀上皮的頂端膜和基底側膜中均有分布，Welter等[19]研究發現豬結腸上皮的頂膜和基底膜都有MCT1表達分布，Kirat 等[15-16]研究發現犢牛與成年山羊盲腸、結腸中MCT1 蛋白在上皮細胞頂端膜及基底側膜均有分布，但以基底側膜為主。而在復層扁平上皮，MCT1 主要分布于棘層和基底層細胞基底側膜上[23]。由此可見，MCT1 的細胞分布特點與將消化道上皮細胞中的單羧酸轉運入血液的功能特點相吻合，MCT1在消化道上皮的分布特點滿足了其吸收轉運營養物質的需要。

圖3 MCT1 在小牛胃腸道的mRNA 表達[15]Fig.3 mRNA expression of MCT1 in gastrointestinal tract of calf[15]

2.2 MCT1 基于CD147 蛋白的細胞膜定位

細胞膜蛋白在內質網核糖體中翻譯合成，在高爾基體中裝配加工后分別通過細胞頂端膜和基底側膜分選信號途徑特異性運輸到細胞表面。Pfannkuche等[24]研究發現MCT3 和MCT4 主要依賴于基底側膜分選信號通路特異性定位到細胞基底側膜表達，而MCT1 不依賴基底側膜分選信號通路，而是通過CD147 蛋白輔助運輸到細胞基底側膜表達。CD147 是一種廣泛表達于多種細胞漿膜上的29 kDa 跨膜糖蛋白，與免疫球蛋白具有較高的同源性，又稱為細胞外基質金屬蛋白酶誘導物。Wilson 等[25]發現在細胞中共同轉染MCT1 和CD147 較單獨轉染MCT1 顯著提高了腸道細胞對乳酸的吸收速率和細胞膜MCT1 的表達量。通過免疫共沉淀技術發現不同細胞系中MCT1 與CD147 蛋白相互集聚分布于細胞膜上[25-26]。蛋白質結構分析發現CD147 是一種單跨膜糖蛋白，N 端位于細胞外，C 端位于細胞質，單個CD147 通過其細胞質中C 段與單個MCT1 細胞質中的C 端和N 端連接(圖4)。同時CD147 的C 端與另一個CD147 的C 端相連，形成二聚體。因此，CD147 蛋白是MCT1 定位細胞膜行使單羧酸轉運的核心調控因子[27]。

圖4 MCT1 與CD147 的結合方式[16]Fig.4 The combination mode of MCT1 and CD147[16]

3 MCT1 轉運單羧酸的機制

MCT1 作為主動吸收營養物質的轉運蛋白，其轉運動力來自細胞外H＋濃度梯度。隨著培養基中pH值由7.5 降至5.5，Caco-2 細胞對γ-羥基丁酸和乳酸的吸收速度顯著提高，而培養基中的Na＋對上述底物的吸收速度無顯著影響[28]。Kirat 等[15]研究也發現隨著瘤胃上皮細胞培養基中pH 下降，丁酸、乙酸的吸收速度增加，但當pH 值降到5.5 以下，其對MCT1 的吸收能力無顯著影響。Yan 等[29]報道培養基pH 降低，可促進瘤胃上皮細胞中MCT1 基因的表達。Ritzhaupt等[30]提出細胞外pH 不是影響MCT1 吸收功能的根本因素，其根本因素是細胞內外的pH 梯度，當細胞內外pH 值相等，或者細胞外pH 值高于細胞內時，腸道上皮細胞中MCT1 對乳酸的轉運功能均較弱，僅當細胞外pH 值低于細胞內pH 值時MCT1 對乳酸的轉運能力最強。

研究進一步發現MCT1 是通過H＋偶聯方式同向轉運單羧酸[31]。MCT1 的H＋共轉運機制主要基于膜通道蛋白的“搖臂開關”(Rocher switch)理論[16]。該蛋白C-端的6 個跨膜區域與N-端的6 個跨膜區域組成2 個搖臂，通過相應交替的位于通道中底物集合位點，專一接合細胞外或細胞質中的底物。當細胞外H＋較少時，MCT1 細胞外通道口處于閉合狀態，底物結合位點Lys38 被埋于通道中(Lys38 不帶電荷)，MCT1 處于沒有轉運物質功能的靜息狀態。細胞外H＋增多使Lys38 質子化，MCT1 細胞外通道口打開，Lys38 底物結合位點暴露并結合單羧酸陰離子，進而將單羧酸傳遞給天冬酰胺和精氨酸電子對(Asp302-和Arg306＋)，此時Lys38 去質子化MCT1 恢復到閉合狀態，并使Asp302-和Arg306＋暴露于細胞質釋放單羧酸[32]。MCT1 協同轉運質子和單羧酸陰離子時存在先后順序，即H＋先與MCT1 結合，引起MCT1 構象變化，而后MCT1 再與單羧酸陰離子結合，同向轉運通過細胞質膜釋放。

圖5 MCT1 的乳酸轉運過程[19]Fig.5 The lactic acid transport of MCT1[19]

另外有研究發現MCT1 可能介導瘤胃上皮基底膜VFAs 與HCO3-的交換轉運機制。Dengler 等[33]通過在瘤胃上皮細胞培養基中添加或不添加HCO3-，發現添加HCO3-可促進瘤胃上皮對乙酸和丁酸的轉運速度，隨著培養基中HCO3-濃度增加，VFAs 轉運速度增加，添加MCT1 抑制劑后乙酸的外排速度顯著下降，因此認為瘤胃基底膜上存在VFA 與HCO3-的交換轉運機制，并且認為MCT1 參與了乙酸的該轉運過程[34]。但其具體轉運過程尚不清楚，有待進一步研究。

4 消化道MCT1 的影響因素及調控機理

4.1 年齡對消化道MCT1 的影響

年齡對消化道MCT1 影響的研究主要集中在反芻動物瘤胃發育上。Koho 等[21]研究發現初生羔羊瘤胃中MCT1 表達量極低，在2 周齡時瘤胃MCT1 表達量顯著升高，十二指腸中MCT1 表達量在初生時最高，而后顯著下降。Pfannkuche 等[24]研究發現年齡對MCT1的亞細胞定位存在影響，通過比較出生后24 h 屠宰和4日齡屠宰的犢牛，發現初生犢牛MCT1 表達量較低，且主要分布于瘤胃基底層細胞的頂膜，而4 d 后MCT1表達量升高，且主要分布于基底層細胞基底側膜。

4.2 日糧對消化道MCT1 的影響

動物飼糧的營養組成和結構對消化道上皮MCT1表達和轉運功能有重要影響，在單胃動物方面的研究表明飼喂纖維類飼料可促進后腸道微生物發酵，增加后腸MCT1 表達量，Kirat 等[35]發現飼喂果膠后小鼠各段腸道MCT1 蛋白表達量顯著升高，盲腸和結腸升高幅度最大，而后將小鼠結腸采樣后進行細胞培養，發現果膠飼喂小鼠結腸細胞對乙酸的轉運能力顯著高于對照組小鼠，推測果膠可作為小鼠腸道微生物發酵底物，產生更多的VFAs，從而促進MCT1 的表達和轉運功能。Villodre 等[36]研究了豬腸道微生物代謝對MCT1表達的影響發現，高蛋白日糧減少豬結腸MCT1 的表達。MCT1 表達量與消化道內乳酸含量呈正相關，與NH3和腐胺含量呈顯著負相關。

日糧與MCT1 更多的研究集中于反芻動物瘤胃上，補飼精料以及提高精補料飼喂量可提高反芻動物瘤胃上皮MCT1 基因與蛋白表達量[37]。增加日糧中谷物飼料的比例也可提高反芻動物瘤胃中MCT1 表達量[21，38-39]。因此，研究者希望通過日糧調控犢牛瘤胃中MCT1 表達，促進瘤胃健康發育。Laarman 等[40]比較了代乳料＋干草與代乳料＋干草＋開食料對13～50日齡犢牛瘤胃上皮MCT1 表達的影響，試驗中兩組牛能量攝入相近，結果表明固體開食料顯著提高瘤胃VFAs產量，增加MCT1 表達量，并且提出VFAs 可以提高瘤胃中MCT1 的表達。然而，Flaga 等[41]研究了流體飼料(母乳和人工乳)對5 ～26日齡犢牛瘤胃上皮MCT1的影響，認為流體飼料直接進入犢牛皺胃，對瘤胃的刺激較少，結果顯示母乳比人工乳更能促進瘤胃MCT1表達，并認為母乳中富含的生物活性物質可能是促進瘤胃MCT1 表達的重要因素。Pfannkuche 等[24]的研究也發現初乳能夠增加瘤胃上皮MCT1 表達分布，并提出VFAs 不是啟動MCT1 轉錄表達的唯一因子，飼料中的生物活性物質、激素以及機體生理狀態等均能影響消化道上皮中MCT1 的表達和功能。

4.3 VFAs 對消化道MCT1 的影響及調控

研究表明MCT1 不僅能轉運消化道中VFAs，反之VFAs 可以調控MCT1 的表達和功能。Cuff 等[42]研究了VFAs 對體外培養的人結腸粘膜細胞中MCT1 表達的影響，發現隨著丁酸鈉濃度(0 ～5 mmol·L-1)和處理時間(0、6、12、24、48、72 h)的增加，MCT1 基因與蛋白表達量均顯著升高，而乙酸和丙酸對MCT1 無調控作用。利用放射性標記方法發現丁酸吸收的最大速度顯著增加，然而米氏常數沒有變化，說明丁酸鈉吸收的增加并不是通過改變其與MCT1 的親和力，而是通過增加細胞膜上MCT1 的表達豐度來實現的。進一步研究發現丁酸可誘導MCT1 轉錄，延長MCT1 mRNA 的半衰期[42]。研究發現丁酸可作為內源性配體與細胞表面短鏈脂肪酸受體GPR41 結合并激活下游細胞信號通路調控細胞營養代謝[43]。Borthakur 等[44]研究發現利用G 蛋白偶聯受體抑制劑處理腸道上皮培養基后丁酸的吸收速率顯著下降，利用轉染抑制GPR41 受體表達后顯著降低了MCT 蛋白在細胞頂膜的表達量。進一步研究發現隨著細胞培養基中丁酸作用時間的延長，細胞質中環磷酸腺苷 ( cyclic adenosine monophosphere，cAMP)濃度降低，而通過cAMP 促進劑提高細胞內cAMP 含量可抑制MCT1 的轉運功能，提示cAMP 是丁酸調控MCT1 轉錄表達的一個重要信號分子。Borthakur 等[45]發現丁酸可以激活Cacao2 和HT-29 細胞系中MCT1 啟動子區域，NF-κB 信號途徑抑制劑可顯著抑制丁酸對MCT1 啟動子的上調作用。同時丁酸處理可以促進Caco2 細胞質中NF-κB 轉錄調控因子進入細胞核，而丙酸、乙酸則無此效果，說明丁酸可通過NF-κB 途徑促進MCT1 表達。

4.4 腸道炎癥及促炎因子對消化道MCT1 的影響及調控

炎癥是NF-κB 信號途徑的主要影響因素，研究發現腸道炎癥及促炎因子對MCT1 的表達和功能具有調控作用。Borthakur 等[46]通過研究腸道上皮細胞感染致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌發現，僅致病性大腸桿菌可抑制丁酸的吸收速度和MCT1 的表達量。Thibault 等[47]通過外源藥物誘導小鼠產生腸炎，發現腸炎小鼠盲腸、結腸上皮中MCT1 基因及其蛋白表達量顯著下降。而腸道上皮細胞培養基中加入γ 干擾素(γ-interferon，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)后顯著抑制MCT1 基因表達，以及丁酸的轉運能力。而加入NF-κB 信號通路阻斷劑對促炎因子抑制MCT1 的作用無顯著影響[48]，說明促炎因子不是通過該通路影響MCT1 的表達。Thibault 等[49]研究顯示炎癥腸粘膜中丁酸鹽氧化率降低，其原因與炎癥引起MCT1 表達量下調導致腸上皮細胞胞內丁酸鹽濃度降低有關；而MCT-1 表達量下調表明與WNT/β-catenin 通路活性降低有關。Harris等[50]研究表明WNT/β-catenin 通路具有氧化應激調控作用，從而介導炎癥調控的功能。因此，WNT/βcatenin 通路調控MCT-1 基因表達可能是炎癥調控的潛在機制。

4.5 激素對消化道MCT1 的影響及調控

生長抑素是一種抗炎癥和抗腹瀉激素，并且能夠抑制促炎因子的分泌[51-52]。Saksena 等[53]研究報道生長抑素(somatostatin，SST)可促進MCT1 和CD147在Caco2 細胞膜的表達，Caco2 細胞系中添加SST 可顯著提高60%～70%的丁酸吸收量，且對基底膜側丁酸轉運能力的促進作用更強，采用生長抑素類似物seglitide 同樣可激活生長抑素受體2(somatostatin，receptor 2 SSTR2))，促進Caco2 細胞對丁酸的轉運。p38MAPK 阻斷劑可抑制生長抑素促進Caco2 細胞轉運丁酸的能力，而Erk1/2 阻斷劑對該途徑無抑制效果。生長抑素可通過p38MAPK 途徑促進MCT1 對丁酸的吸收轉運[54]。瘦素可顯著促進MCT 介導的丁酸轉運速率，一方面瘦素可增加Caco 細胞內MCT1 蛋白量而不影響CD147 表達，另一方面可促進CD147/MCT1 轉移到細胞膜[55-56]。性激素也已被證實具有MCT1 調控作用。Enoki 等[57]發現小鼠睪酮分泌的增加可以促進骨骼肌中MCT1 蛋白的表達。此外，Aveseh 等[58]通過抑制人MC4-L2 乳腺癌-同源BALB/c 小鼠中雌激素相關受體α 的表達，降低MCT1 的表達，表明雌激素具有調控MCT1 活性的功能。Cao等[59]進一步研究發現女性的性激素，雌二醇、孕酮和黃體生成激素，具有下調MCT1 mRNA 的表達和降低其膜轉運功能的作用。因此，通過研究不同激素水平及類型對MCT1 的調控具有重要意義。

5 結論與展望

MCT1 是一種H＋同向共轉運蛋白，其表達分布存在種間及組織間差異，主要分布于單胃動物后腸和反芻動物前胃和后腸上皮細胞基底側膜上，負責消化道中VFAs、酮體、乳酸等單羧酸消化產物的吸收入血。MCT1 的正確定位表達需要分子伴侶蛋白CD147 的輔助。動物年齡、飼糧組成和營養水平均可影響消化道中MCT1 的表達量和吸收轉運功能。MCT1 的轉運底物丁酸可以通過GPR109A/cAMP/NF-κB 信號通路促進消化道MCT1 的細胞核轉錄與表達水平。消化道炎癥及促炎因子TNF-a、IFN-r 等可抑制MCT1 的表達和物質吸收功能，而激素生長抑素、瘦素等可能通過p30MAPK 信號通路促進MCT1 的表達。因此，有必要加強MCT1 表達和功能相關的調控研究，并基于此研發MCT1 的外源調控劑，從而推動家畜尤其是反芻動物的高效生產。