洛鉑腹腔灌注化療作用于進展期結直腸癌裸鼠動物模型的實驗研究*

練計明 王海鵬 朱襲嘉 高雪原 李 皓 田小林 龐凌坤 李盛國 甘澤林

桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西桂林市 541199

結直腸癌是我國最常見的消化道腫瘤之一，嚴重威脅著我國人民的健康。近年來，我國結直腸癌已經上升為我國男性第五位、女性第四位高發(fā)性惡性腫瘤，死亡率已位居我國惡性腫瘤第五位[1]。目前在臨床上對結直腸癌提出了以手術治療為主，化療、放療、免疫治療為輔的多學科綜合治療的理念，而輔助化療是結直腸癌綜合治療的重要組成部分。洛鉑為第三代鉑類化療藥物，具有水溶性好、抗瘤譜廣、抗瘤活性強及不良反應少等諸多特點[2]，具有明顯的腹腔灌注化療藥代動力學優(yōu)勢[3]。研究發(fā)現其療效與洛鉑作用部位、作用有效濃度及作用時間有關,其不良反應則與外周血藥濃度有關，主要副作用表現為血小板減少、白細胞減少、貧血[4]。常規(guī)靜脈輸注全身化療的毒、副作用明顯，而腹腔灌注化療，因藥物不經過血液從而可以減少藥物毒、副作用[5]；而且腹腔灌注化療可以提高靶區(qū)域或靶器官的藥物濃度，以達到更好的消滅患者體內癌細胞的效果。洛鉑腹腔灌注化療由于其獨特的給藥方法,可實現局部區(qū)域的腫瘤靶向治療,具有局部藥物濃度高、全身血藥濃度低、不良反應少等優(yōu)點[6]。

因此設計本實驗，探討洛鉑腹腔灌注化療對進展期結直腸癌裸鼠動物模型的治療效果，從而為進展期結直腸癌的臨床多途徑治療及預后等提供有效的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 結直腸癌細胞株lovo由上海中科院細胞庫提供。25只alb/c裸鼠、雄性，4～6周齡，體重15～20g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。注射用洛鉑購自海南長安國際制藥有限公司。5%葡萄糖溶液購自廣東圣戈生物科技有限公司。生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)購自撫州市醫(yī)寶城醫(yī)療器械有限公司。DMEM培養(yǎng)液購自廣州威佳科技有限公司。胎牛血清購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 進展期結直腸癌裸鼠動物模型的制備 將結直腸癌細胞株lovo置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數生長期結直腸癌細胞制成單細胞懸液，細胞密度為1×107個/ml，取0.2ml接種于每只裸鼠腹腔內。接種成功后于第5～7天內觀察裸鼠腹腔內成瘤情況，選取成瘤成功且符合實驗標準的裸鼠20只；治療前裸鼠、精神、飲食、活動、排便等無異常。

1.3 實驗步驟 將成瘤成功且符合實驗標準的20只裸鼠隨機分為對照組和實驗組,各10只，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，每隔3d更換飼養(yǎng)籠及其飼料、飲用水等。以裸鼠成瘤成功為實驗起點，對照組每隔7d(第1天、第8天、第15天，以此類推)利用1ml注射器從裸鼠腹腔注入0.4ml的0.9%氯化鈉溶液，注入前需碘伏消毒預防感染，成功注入藥物并拔出針頭后棉簽輕柔按壓注射點1min，最后按摩裸鼠腹腔使注入藥物在裸鼠腹腔均勻分布；實驗組每隔7d以同樣的給藥方式注射0.4ml洛鉑溶液(洛鉑10mg/kg+5%GS)行腹腔灌注化療。

1.4 測量指標 每天密切觀察裸鼠腹腔腫瘤的生長情況、裸鼠生活狀態(tài)并記錄兩組裸鼠存活情況，每隔4d稱量并記錄裸鼠重量，最后計算抑癌率；抑癌率=(m對照組-m實驗組)/m對照組×100%(利用治療后兩組裸鼠腫瘤重量的數據計算抑癌率)；剝瘤稱重時為達到腫瘤精準稱重，需觀察腫瘤有無轉移至其他器官和浸潤周圍組織。

2 結果

2.1 兩組裸鼠成瘤率及治療后各指標比較 裸鼠接種成功后于第5～7天觀察裸鼠腹腔內成瘤情況，腹腔內均形成大小不等的腫瘤，接種點無紅腫破潰表現且實驗裸鼠成瘤率100%。治療前兩組裸鼠重量、腹腔內腫瘤大小差異無統計學意義(P>0.05)。治療后對照組腫瘤重量高于實驗組(P<0.05)，實驗組抑癌率高于對照組(P<0.05)，實驗組裸鼠重量高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組治療前后實驗結果對比

2.2 兩組裸鼠存活情況比較 實驗組平均生存時間為48.6d，高于對照組的34.3d(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組生存曲線

3 討論

腹腔種植轉移是治療結直腸癌失敗的一個重要原因[7]，7%～15%的患者在初始手術時便已發(fā)現存在腹腔種植轉移，另有4%～19%的患者在根治術后出現腹腔種植轉移[8]。由于洛鉑的藥代動力學特點及腹腔灌注化療的高選擇性靶向給藥方式，洛鉑腹腔灌注化療被認為是預防結直腸癌術后腹腔種植轉移及治療結直腸癌腹腔種植轉移的有效方式。蘇昊等[9]研究表明洛鉑術中腹腔灌洗化療并不增加術后并發(fā)癥的發(fā)生，亦不影響腸道功能的正常恢復，同時也沒有明顯的化療藥物的毒副反應，具有良好的安全性和可行性。

許多研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅與腫瘤細胞的分化和細胞增殖過度有關，而且與細胞凋亡的減少有關。細胞凋亡可以通過多種凋亡相關蛋白來調控。最重要的一種凋亡相關蛋白是caspase家族，這是一種具有特定底物的高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族。在線粒體啟動的細胞凋亡途徑中，caspase的激活是由多聚體細胞色素C復合物的形成觸發(fā)的，該復合物在募集和激活 procaspase-9 中起著非常重要的作用。然后，活化的 caspase-9 會裂解并激活下游的 caspase，例如 caspase-3、-6 和-7。據報道，Caspase-8 在細胞色素 c 依賴性細胞凋亡中發(fā)揮作用，而 caspase-8 激活與 Fas 受體誘導的細胞凋亡有關，并可導致Bid(Bcl-2家族的促凋亡成員)的裂解和活化。截短的Bid從細胞質轉移到線粒體，似乎起著拮抗抗凋亡Bcl-2的作用，從而引起細胞色素c從線粒體外移和下游caspase-9/3活化。有脫細胞和體外表達系統的證據表明，caspase-3可誘導上游啟動因子caspase-8的裂解和活化。有研究表明洛鉑在體外可顯著抑制結直腸癌細胞的生長，并呈濃度依賴性，可誘導LOVO細胞凋亡。這種凋亡可能發(fā)生在S期，且caspase-8和caspase-9的表達上調引起了caspase-3的表達上調是可能的機制之一[10]。

此外，近期研究發(fā)現洛鉑可通過細胞焦亡機制誘導結直腸癌細胞死亡，洛鉑可誘導活性氧(ROS)升高和JNK磷酸化。ROS清除劑 NAC可完全逆轉洛鉑處理的HT-29和HCT116的焦亡及JNK磷酸化。活化的JNK將Bax募集到線粒體，從而刺激細胞色素c釋放到胞質中去，隨后是caspase-3/-9的裂解和焦亡的誘導。因此，洛鉑是通過 ROS/JNK信號通路和Bax-caspase-GSDME 途徑誘導癌細胞的焦亡[11]。

本實驗成功進行了洛鉑腹腔灌注化療對進展期結直腸癌裸鼠動物模型的研究，分析了洛鉑腹腔灌注化療對裸鼠腹腔內結直腸癌的抑制作用，實驗數據顯示：對照組腫瘤重量高于實驗組且差異有統計學意義[(2.86±0.26)g、(1.49±0.15)g，P<0.05]、對照組和實驗組的抑癌率有統計學差異(0.0%、48.3%,P<0.05)，表明治療后實驗組的裸鼠腹腔腫瘤生長受到一定程度上的抑制，而對照組腹腔腫瘤生長較快。治療后實驗組裸鼠重量高于對照組[(14.35±0.21)g、(16.18±0.17)g，P<0.05]，可能與腫瘤大量消耗裸鼠營養(yǎng)有關。兩組的存活情況表明實驗組裸鼠存活時間比對照組延長。

綜上所述，洛鉑腹腔灌注化療對裸鼠進展期結直腸癌生長具有明顯抑制作用并延長成瘤裸鼠的存活時間。同時，本次實驗為進展期結直腸癌的臨床多途徑治療及預后等提供有效的實驗依據。