SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)宿主炎性損傷的毒理學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展

車 琳，蘭 尤，林錦賢，林育純

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點實驗室，福建廈門361102)

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，隸屬于冠狀病毒科β屬[1].SARS-CoV與SARS-CoV-2的全基因組水平相似度約79%，且兩者的棘突蛋白(S蛋白)有著相同的宿主細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體.然而，SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2受體結(jié)合的親和力是SARS-CoV的S蛋白的10～20倍[2-3]，提示兩者對宿主細(xì)胞誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)存在差異.SARS-CoV-2感染引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)具有全球大流行特征，被列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[4].截至2020年7月30日，COVID-19已蔓延至200多個國家或地區(qū)，確診病例累計超過1 680萬例，死亡超過66萬例[5].

圖1 SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)宿主炎性損傷的毒理學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展示意圖Fig.1Schematic diagram of the research advances in the toxicological mechanism of inflammatory injury induced by SARS-CoV-2 infection

SARS-CoV-2感染通過其外膜S蛋白與人體細(xì)胞表面的ACE2受體結(jié)合，經(jīng)由激活病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)誘導(dǎo)宿主不同靶細(xì)胞的毒性損傷[6].其中肺是SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)毒性作用的主要靶器官，腸道、肝臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多器官系統(tǒng)也會發(fā)生不同程度的毒性損傷[7].基于COVID-19的流行病學(xué)調(diào)查、臨床觀察以及SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析、抗病毒和免疫治療等研究，人們對病毒傳播、致病機(jī)制、疫苗開發(fā)和治療性抗體制備等已有了初步認(rèn)識;但SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴、介導(dǎo)機(jī)體免疫毒性反應(yīng)及其治療藥物所介導(dǎo)的機(jī)體毒性損傷問題，特別是細(xì)胞器、細(xì)胞、靶器官、個體等毒性作用級聯(lián)模式，以及關(guān)鍵毒性通路和早期生物標(biāo)志等亟待闡明.因此，本文旨在綜述SARS-CoV-2作為人群環(huán)境暴露中的一種新型生物因素，介導(dǎo)機(jī)體毒性損傷的作用機(jī)制研究進(jìn)展，并討論其對現(xiàn)代毒理學(xué)發(fā)展的挑戰(zhàn)(圖1)，為探索環(huán)境生物因素暴露(如SARS-CoV-2等感染)誘導(dǎo)機(jī)體毒性損傷的靶向干預(yù)和毒理學(xué)安全性評價提供新視野.

1 SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)毒性損傷的人體反應(yīng)性和群體易感性差異

隨著大量SARS-CoV-2感染的臨床觀察、臨床試驗和流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)結(jié)果相繼被報道，相關(guān)毒性損傷的人體反應(yīng)性和群體易感性差異也逐漸被揭示.Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，0～14歲的兒童相較于15～64歲的成年人更不易被SARS-CoV-2感染(比值比(OR)=0.34，95%置信區(qū)間(CI)=0.24～0.49)；但65歲以上的老齡人更易被SARS-CoV-2感染(OR=1.47，95%CI=1.12～1.92).Lu等[9]通過對171名感染SARS-CoV-2的兒童進(jìn)行疾病譜分析發(fā)現(xiàn)，與成年患者相比，大多數(shù)兒童患者的臨床過程較溫和，多表現(xiàn)為無癥狀感染.上述結(jié)果提示年齡是SARS-CoV-2引起不同人群染病嚴(yán)重程度的易感因素之一.

Zhao等[10]對3 694例COVID-19患者與23 386例正常人群的血型分布進(jìn)行病例對照研究發(fā)現(xiàn)，與非A型血患者相比，A型血患者被感染為COVID-19的風(fēng)險明顯增高(OR=1.279，95%CI=1.136～1.440)；而與非O型血患者相比，O型血患者感染風(fēng)險顯著降低(OR=0.680，95%CI=0.599～0.771).上述結(jié)果提示ABO血型是COVID-19敏感性差異的易感因素.此外，前期研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)如人類白細(xì)胞抗原B基因(HLA-B-4601)、趨化因子配體2基因(CCL2-G2518A)和甘露糖結(jié)合凝集素基因(MBL)第54位密碼子突變等，均可影響患者對于SARS-CoV感染的易感和預(yù)后[11-12].新近研究報道也發(fā)現(xiàn)，跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)的4個突變體(rs464397、rs469390、rs2070788和rs383510)均影響其在肺組織中的表達(dá)；相較于亞洲人群，TMPRSS2突變體在歐美人群中的發(fā)生頻率較高，表明歐美人群可能相對較易感染SARS-CoV-2[13].上述結(jié)果提示SARS-CoV感染與毒性損傷的人體反應(yīng)性和群體易感性(如表觀遺傳毒理)差異存在潛在關(guān)聯(lián)，為COVID-19的人群易感性差異及其與靶向毒性作用關(guān)聯(lián)性的機(jī)制研究提供了線索.Kim等[14]利用DNA和RNA兩種互補的測序技術(shù)，展示了SARS-CoV-2轉(zhuǎn)錄組和表觀轉(zhuǎn)錄組的高分辨率圖，發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和RNA修飾功能可能有助于病毒存活和免疫逃逸，為闡明SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的宿主毒性損傷的個體差異提供了依據(jù).Shen等[15]通過對46例COVID-19患者、25例非COVID-19患者和28例健康對照者的血清樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，篩選出差異顯著的22種血清蛋白(如SSA1、SAA2和CRP)和7種代謝物(如載脂蛋白1)的表達(dá)水平來預(yù)測重癥病例進(jìn)程，并通過機(jī)器學(xué)習(xí)模型在訓(xùn)練中獲得了93.5% 的總體準(zhǔn)確率，這為臨床診斷提供了一定的實驗和理論基礎(chǔ).上述結(jié)果提示使用特定的血清蛋白組分和代謝物等毒性作用效應(yīng)標(biāo)志可以預(yù)測COVID-19的進(jìn)展.

2 SARS-CoV-2感染與靶器官毒理學(xué)機(jī)制

SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)宿主多器官功能障礙是機(jī)體毒性損傷的直觀表現(xiàn)[7].SARS-CoV-2感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞膜蛋白ACE/ACE2比值升高，促使ACE-血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)軸和ACE2-Ang-(1-7)軸平衡失調(diào)，引發(fā)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、IL-6、趨化因子等炎癥因子高表達(dá)，最終引起調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(RCD)，介導(dǎo)多功能臟器的損傷[16].研究發(fā)現(xiàn)ACE2主要表達(dá)于肺、胃腸道、肝、腎、心等臟器[6-7,17]，提示這些可能成為SARS-CoV-2感染宿主后產(chǎn)生毒性作用和發(fā)生功能損傷的靶器官.

2.1 肺毒性損傷

肺臟是外源環(huán)境因素暴露的重要靶器官.外源因素通過呼吸道暴露不僅可以損傷呼吸道和肺臟，也可通過血流輸送到其他組織或臟器，與全身性損害密切相關(guān).經(jīng)呼吸道飛沫傳播的SARS-CoV-2進(jìn)入氣管-支氣管-肺泡后，肺臟成為其主要感染的靶作用器官[18].COVID-19患者的呼吸毒理學(xué)特征主要表現(xiàn)為彌漫性的肺泡損傷，包括纖維蛋白滲出、炎癥細(xì)胞浸潤和彌漫性Ⅱ型肺泡細(xì)胞增生[19].研究表明，SARS-CoV-2感染可能首先在上呼吸道(鼻腔和咽部)黏膜上皮細(xì)胞中復(fù)制，并在下呼吸道進(jìn)一步增殖，導(dǎo)致輕度病毒血癥，此階段主要表現(xiàn)為無癥狀感染；隨著SARS-CoV-2載量增加和感染時間延長，淋巴細(xì)胞為主的間質(zhì)炎癥細(xì)胞大量浸潤，肺泡細(xì)胞呈現(xiàn)胞漿雙親性顆粒狀、胞核大且核仁突出的病毒性細(xì)胞病變，這與SARS和中東呼吸綜合征(MERS)極為相似[20].COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果揭示了SARS-CoV-2感染患者的肺泡炎癥細(xì)胞因子譜，進(jìn)一步顯示COVID-19發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞因子(如CCL2/MCP-1、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(CXCL10)/IP-10、CCL3/MIP-1A和CCL4/MIP1B等)過度釋放之間的關(guān)聯(lián)[21].Li等[22]通過免疫病理學(xué)等方法證明，SARS-CoV-2感染Ⅰ型、Ⅱ型肺泡細(xì)胞以及小血管中的內(nèi)皮細(xì)胞，引起細(xì)胞焦亡和凋亡，并導(dǎo)致CD4+、CD8+T細(xì)胞耗竭，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大量浸潤肺組織，促炎性細(xì)胞因子和趨化因子失調(diào)，由此提出SARS-CoV-2患者的嚴(yán)重肺損傷是病毒直接感染和免疫病理損傷共同作用的結(jié)果，重型COVID-19患者的適應(yīng)性免疫反應(yīng)受損和不受控制的炎癥固有反應(yīng)導(dǎo)致局部和系統(tǒng)的靶器官損傷.Zheng等[23]通過對4項研究中的1 286例SARS-CoV-2感染患者進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)實驗室檢查中乳酸脫氫酶(LDH)等生化指標(biāo)活性升高，反映出肺細(xì)胞生物膜通透性或結(jié)構(gòu)損傷、肝腎功能異常.已有研究結(jié)果提示SARS-CoV-2通過識別ACE2受體而感染Ⅱ型肺泡細(xì)胞，損害肺組織進(jìn)而破壞氣血屏障，引起全身性損害[24].

2.2 胃腸道毒性損傷

COVID-19患者糞便中檢出SARS-CoV-2的RNA，其糞口傳播的可能性引起了極大的關(guān)注，并可能對控制和預(yù)防COVID-19構(gòu)成挑戰(zhàn)[25].Xiao等[26]研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2感染的住院患者隨著時間進(jìn)展，入院后第10天出現(xiàn)消化道出血，胃腸內(nèi)窺鏡檢查顯示黏膜損傷，胃腸道上皮細(xì)胞活檢樣品免疫熒光顯示ACE2蛋白水平升高；對患者進(jìn)行胃腸內(nèi)窺鏡檢查發(fā)現(xiàn)，病例樣本中胃、十二指腸和直腸的固有層可見大量浸潤性漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞間質(zhì)性水腫，表明胃腸道黏膜局部免疫細(xì)胞被激活.除SARS-CoV-2腸道局部感染外，很少有COVID-19患者(約1%)會發(fā)生肺部感染后的病毒血癥，但可能導(dǎo)致對ACE2靶器官(如腎臟和腸)的繼發(fā)性作用[27].Neurath等[28]和Pan等[29]報道，SARS-CoV-2患者胃腸道的樣本檢測中發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-2、IL-7、IL-8、IL-10和MCP-1的水平均顯著性升高，隨后外周血清中檢出病毒核衣殼蛋白表達(dá)，表明SARS-CoV-2可能在胃腸道中從感染細(xì)胞傳播到未感染細(xì)胞.胃腸道暴露感染的腸道上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子，可迅速導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞在胃腸道感染部位的局部積聚；雖然嗜中性粒細(xì)胞等扮演著抗病毒的重要作用，但是其分泌的細(xì)胞因子和趨化因子會同時吸引更多免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)增強[30].SARS-CoV-2感染的胃腸道中這種細(xì)胞因子風(fēng)暴可能導(dǎo)致繼發(fā)性吞噬淋巴細(xì)胞，引起胃腸道區(qū)域免疫調(diào)節(jié)失衡，引發(fā)重癥，這與多器官衰竭和高致死率有關(guān)[31].上述結(jié)果提示SARS-CoV-2感染可誘導(dǎo)機(jī)體胃腸道毒性反應(yīng)，這為糞口傳播途徑預(yù)防和控制提供了依據(jù).

2.3 肝臟毒性損傷

以SARS-CoV感染作為參照，在對SARS患者進(jìn)行尸檢時，發(fā)現(xiàn)肝臟的實質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中有大量病毒顆粒，并檢測到SARS-CoV的基因組，且氣球樣肝細(xì)胞顯著增加，SARS-CoV特異性蛋白7a可通過Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，提示SARS-CoV會直接攻擊肝組織和細(xì)胞，引起肝損傷[32].類似地，早期臨床研究表明COVID-19患者也有肝損傷生化證據(jù)，表現(xiàn)為血清肝功能檢查中肝酶異常，包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等酶活性升高，且在重型和危重型組患者中均高于普通型組患者；在COVID-19患者中，肝損傷的潛在機(jī)制可能包括心理壓力、全身性炎癥反應(yīng)、藥物毒性以及先前存在的肝臟疾病進(jìn)展，即從單純性脂肪肝到脂肪性肝炎[33].COVID-19患者尸檢的系統(tǒng)解剖顯示肝組織異常，如肝腫大、伴有小葉局灶性壞死和中性粒細(xì)胞浸潤的肝細(xì)胞泡性脂肪變性、門區(qū)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，及肝竇充血伴微血栓形成[26].Wang等[34]通過透射電子顯微鏡確定COVID-19患者的肝臟中有典型的SARS-CoV-2冠狀病毒顆粒，并呈現(xiàn)病毒體在胞質(zhì)中的棘突結(jié)構(gòu)，顯示出表面增厚的包膜，尺寸范圍在60～120 nm之間，表明SARS-CoV-2不僅能夠進(jìn)入肝細(xì)胞而且還能在肝細(xì)胞中復(fù)制，而且感染的肝細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的線粒體腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，以致大量肝細(xì)胞凋亡和出現(xiàn)某些雙核肝細(xì)胞等病變，由此提出SARS-CoV-2感染肝臟可直接導(dǎo)致COVID-19患者的肝功能損傷.雖然ACE2的定位不能完全解釋SARS-CoV-2的肝臟嗜性，但是提示可能存在其他ACE2受體或共受體，且在病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后ACE2的表達(dá)被誘導(dǎo)上調(diào).

2.4 腎臟毒性損傷

腎臟的生理特性決定了其作為外源因素暴露誘發(fā)毒性作用及易感性的一個重要靶器官，在外源生物因素感染引起腎臟損傷時容易表現(xiàn)為全身中毒癥狀.SARS-CoV-2的受體蛋白ACE2在腎臟近曲小管上皮細(xì)胞、遠(yuǎn)曲小管和腎集合管中高表達(dá)，比呼吸道中高出100倍[35].Li等[17]報道機(jī)體感染SARS-CoV-2后腎臟功能損傷會隨著時間而發(fā)展，在59例COVID-19患者中63%出現(xiàn)蛋白尿、腎水腫和尿毒癥等腎毒性損傷.Pan等[29]采用手術(shù)切除的人腎臟，經(jīng)消化后取上清進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq)分析，發(fā)現(xiàn)ACE2與TMPRSS2在足細(xì)胞和近曲小管細(xì)胞中共表達(dá)是決定SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因素，提示這些細(xì)胞可成為SARS-CoV-2感染時作用于腎臟的靶向宿主細(xì)胞.此外，感染者尿液樣本的腎損傷指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)血清肌酐、血尿素氮(BUN)顯著性升高[36]，提示SARS-CoV-2感染可誘導(dǎo)宿主腎小球濾過率(GFR)改變和急性腎損傷(AKI)發(fā)生.

2.5 心臟毒性損傷

心臟中ACE2的表達(dá)低于腸道和腎臟中的表達(dá)，但高于SARS-CoV-2主要靶器官肺中的表達(dá)，表明心臟有潛在的易感性[37].一項加拿大多倫多地區(qū)SARS感染的21名患者尸檢報告顯示：心肌組織中能夠檢測出SARS-CoV的基因組，且呈現(xiàn)間質(zhì)纖維化，心肌細(xì)胞肥大并伴有大量巨噬細(xì)胞浸潤；臨床數(shù)據(jù)則顯示，心臟檢測出SARS-CoV感染的患者病情更重，存活時間更短；進(jìn)一步采用ACE2基因突變體(Ace2-/y)小鼠及C57BL/6小鼠證實心肌組織也可以被SARS-CoV感染，而ACE2全基因敲除后心肌組織則沒有SARS-CoV感染，提示SARS-CoV感染有ACE2依賴性[38].SARS-CoV-2可能通過ACE2相關(guān)的信號通路誘導(dǎo)Th1與Th2反應(yīng)失衡，引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴和呼吸功能障礙，導(dǎo)致低氧血癥，誘發(fā)心臟損害，主要表現(xiàn)為高敏感性心肌肌鈣蛋白Ⅰ(hs-cTnⅠ)等心肌損傷生物標(biāo)志水平升高[39].Hendren等[40]進(jìn)一步指出，SARS-CoV-2誘發(fā)的急性心肌損傷可能會加重COVID-19伴發(fā)的急性呼吸窘迫綜合征、休克、多臟器衰竭，并最終導(dǎo)致死亡.COVID-19的重型、危重型患者與普通型患者相比，血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、cTnⅠ等心肌損傷生物標(biāo)志顯著增加，出現(xiàn)竇性心動過速、房性早搏、ST-T變化等心電圖改變，提示SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的心臟毒性主要表現(xiàn)為急性心肌損傷[41].目前已有的心臟組織病理學(xué)報道中，10%左右的COVID-19患者出現(xiàn)低程度的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和(或)中性粒細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞變性壞死；但SARS-CoV-2引起心肌損傷的確切機(jī)制尚不清楚[7].因此，進(jìn)一步研究SARS-CoV-2感染與心臟毒性損傷的關(guān)聯(lián)性及其毒性作用機(jī)制，有助于COVID-19患者心血管并發(fā)癥防治策略的制定.

2.6 免疫器官/系統(tǒng)毒性損傷

免疫系統(tǒng)負(fù)責(zé)對病毒、細(xì)菌和其他病原體等有害抗原做出反應(yīng)，但同時也可能會對機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面的影響.已有研究證實免疫損傷是SARS發(fā)病的主要機(jī)制，患者尸檢的脾臟顯示出白髓萎縮[42].SARS-CoV-2感染時肺細(xì)胞的破壞同樣會引發(fā)局部免疫反應(yīng)，募集巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子并引發(fā)適應(yīng)性T和B細(xì)胞免疫反應(yīng)；在大多數(shù)情況下，此過程能夠控制感染，但某些情況下發(fā)生免疫反應(yīng)的功能失調(diào)，則導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部疾病甚至全身系統(tǒng)性疾病[43].SARS-CoV-2的S蛋白和核衣殼蛋白(N蛋白)是感染過程中最具免疫原性和大量表達(dá)的蛋白[44].COVID-19患者出現(xiàn)重度淋巴細(xì)胞減少癥，這在其他呼吸道病毒感染中很少見到，并且會因此導(dǎo)致抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的缺陷；同時，細(xì)胞因子風(fēng)暴始于具有固有和適應(yīng)性免疫機(jī)制的細(xì)胞廣泛活化及細(xì)胞因子分泌，兩者共同導(dǎo)致不良的預(yù)后[45].有研究表明COVID-19患者的淋巴結(jié)和脾臟中均發(fā)現(xiàn)出血性壞死和淋巴細(xì)胞耗竭，提示免疫器官損傷是SARS-CoV-2感染引起淋巴細(xì)胞減少的病理基礎(chǔ)[46].Rehman等[47]提出，與成年人相比，兒童臨床炎癥程度輕的可能原因在于胸腺對抗病毒感染的生理作用，即兒童胸腺駐留漿細(xì)胞分泌的固定化功能性抗體在早期可高度增強免疫力.上述結(jié)果提示SARS-CoV2感染可經(jīng)免疫器官/系統(tǒng)的多層次網(wǎng)絡(luò)參與細(xì)胞因子風(fēng)暴毒性作用的誘導(dǎo)和調(diào)控.

2.7 其他臟器毒性損傷

Wang等[48]通過對成人睪丸的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)ACE2的睪丸是SARS-CoV-2感染及其誘導(dǎo)損傷的高危器官，表現(xiàn)為ACE2陽性的精原細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig細(xì)胞)和睪丸支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)中病毒繁殖和傳播相關(guān)基因(如NUP133、POLR2A、JUN、TOP2A、RSF1和PPIA等)表達(dá)上調(diào)，以及精子生成(如ADCY10、METL3和RNF8)、精子分化(如SPAG16、CFAP157和OCA2)、精子活力(如SORD、ANXA5和SLC22A16)等基因表達(dá)顯著下調(diào).Li等[49]在38例COVID-19患者精液樣本中，檢測到6例SARS-CoV-2陽性(包括4例急性感染期和2例恢復(fù)期)，表明SARS-CoV-2可能直接靶向ACE2陽性精原細(xì)胞并破壞精子發(fā)生，提示其與感染者的生殖毒性有關(guān).但這仍存在爭議，Paoli等[50]提出精液的收集與其他生物樣本(如血液)的收集完全不同，并且很容易受到污染，特別是在COVID-19患者中，盡管大多數(shù)研究表明精液感染的風(fēng)險很低，但由病毒引起的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重性差異很大，因此需要進(jìn)行更深入的研究.

在一項COVID-19患者的回顧性病例對照研究中，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀是第二常見的系統(tǒng)癥狀，包括頭痛、頭暈、肌痛、疲勞、惡心和嘔吐(伴有高顱內(nèi)壓，表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)被感染)，提示SARS-CoV-2感染與神經(jīng)系統(tǒng)毒性損傷存在潛在關(guān)聯(lián)[51].Yavarpour-Bali等[52]提出SARS-CoV-2可能通過周圍神經(jīng)的順行和逆行轉(zhuǎn)運侵入神經(jīng)組織，或利用血液進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng).Zhou等[53]通過基因測序發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者的腦脊液中存在SARS-CoV-2，且患者同時被診斷出病毒性腦炎，表明SARS-CoV-2可直接侵襲患者的神經(jīng)系統(tǒng).

此外，Wang等[54]發(fā)現(xiàn)COVID-19患者可出現(xiàn)潛在的輕度胰腺損傷模式，表現(xiàn)為血清淀粉酶或脂肪酶活性升高.結(jié)合SARS可通過ACE2破壞胰島細(xì)胞引起高糖血癥的線索[55]，提示胰腺毒性損傷可能是由SARS-CoV-2介導(dǎo)的胰島細(xì)胞病變直接引起，或與嚴(yán)重疾病背景下繼發(fā)性酶異常有關(guān).

3 SARS-CoV-2感染與細(xì)胞死亡依賴性毒理學(xué)機(jī)制

環(huán)境生物因素暴露誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞死亡，可經(jīng)PAMPs和DAMPs引發(fā)信號級聯(lián)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與影響機(jī)體先天免疫功能和毒性損傷的發(fā)生發(fā)展[56].早期研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV感染肝和腸道上皮細(xì)胞后，可經(jīng)DAMPs (如IL-1)引發(fā)巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[57].最近，F(xiàn)ung等[58]總結(jié)了當(dāng)前人類高致病性SARS-CoV感染誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β和TNF-α)釋放以及對人類適應(yīng)性和炎性細(xì)胞死亡(ICD)的理解，并提出SARS-CoV-2感染通過與宿主抗病毒防御系統(tǒng)之間相互作用介導(dǎo)機(jī)體免疫毒性損傷等重要問題.因此，解析細(xì)胞死亡方式對于闡明SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)的宿主免疫炎性毒性作用通路模式、暴露模型擬合，以及體外(細(xì)胞)和體內(nèi)(動物)試驗毒性作用結(jié)果外推至人具有重要價值，有助于降低SARS-CoV-2感染對高危人群各組織器官的健康危害風(fēng)險.

基于功能方面的差異，2018年細(xì)胞死亡命名委員會將RCD劃分為壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡等ICD，以及細(xì)胞凋亡、自噬依賴性細(xì)胞死亡等其他非ICD形式.ICD是一種促炎形式的程序性細(xì)胞死亡，主要由PAMPs(如革蘭氏陰性菌的脂多糖)和DAMPs (如HMGB1、HSPs家族和S100家族蛋白等)相關(guān)因子所介導(dǎo)[59].SARS-CoV-2感染同樣可能以炎性因子引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴為主要毒性作用機(jī)制，提示細(xì)胞死亡在SARS-CoV-2感染經(jīng)PAMPs和DAMPs相關(guān)通路依賴性的毒性損傷中發(fā)揮重要作用.當(dāng)前，臨床檢驗、結(jié)構(gòu)生物學(xué)病毒結(jié)構(gòu)解析、多維組學(xué)等生物信息學(xué)分析以及體外試驗?zāi)Ｐ偷绕脚_的建立，表明SARS-CoV-2感染可誘導(dǎo)宿主多細(xì)胞類型(如Ⅱ型肺泡細(xì)胞、肝膽管細(xì)胞、腎細(xì)胞和免疫細(xì)胞等)發(fā)生ICD依賴性毒性損傷.Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞以及肺泡巨噬細(xì)胞均可直接暴露于SARS-CoV-2，經(jīng)活化的轉(zhuǎn)錄因子4和金屬硫蛋白2A等基因表達(dá)水平下調(diào)，介導(dǎo)宿主細(xì)胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等響應(yīng)能力降低，導(dǎo)致細(xì)胞ICD依賴性毒性損傷[60-61].

已有研究表明SARS-CoV的S蛋白、N蛋白和膜蛋白可誘導(dǎo)非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)腎細(xì)胞Vero-E6和猴胚胎腎上皮細(xì)胞MARC145啟動凋亡途徑；SARS-CoV的7a蛋白與B細(xì)胞淋巴瘤-XL(Bcl-XL)蛋白可共定位于細(xì)胞的不同膜區(qū)室(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示SARS-CoV感染經(jīng)調(diào)控程序性細(xì)胞死亡介導(dǎo)細(xì)胞毒性損傷[32,62].Zhao等[63]通過衍生肝膽管祖細(xì)胞構(gòu)建的“肝導(dǎo)管類器官”模型研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2感染可直接靶向膽管細(xì)胞，誘導(dǎo)SARS-CoV-2的N蛋白及宿主膽管細(xì)胞關(guān)鍵細(xì)胞凋亡因子CD40、Caspase募集結(jié)構(gòu)域蛋白8(CARD8)和絲氨酸蘇氨酸激酶4(STK4)的表達(dá)，提示宿主膽管細(xì)胞發(fā)生RCD.SARS-CoV-2感染還可誘導(dǎo)宿主實質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，經(jīng)細(xì)胞間通訊作用于間質(zhì)免疫細(xì)胞和(或)通過感染直接作用于免疫細(xì)胞，經(jīng)DAMPs激活下游核因子κB(NF-κB)等炎性信號通路，以啟動焦亡等ICD，導(dǎo)致宿主細(xì)胞炎性毒性損傷的惡性循環(huán)，這是臨床上SARS-CoV-2感染導(dǎo)致病人死亡的主要原因[64].Xiong等[65]從COVID-19患者的BALF和外周血單核細(xì)胞(PBMC)標(biāo)本中分離RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)COVID-19的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞因子(BALF中的CCL2、CXCL10、CCL3和IL-18，以及PBMC中的AREG、NREG1和IL-10等)釋放過多相關(guān)，并揭示SARS-CoV-2誘導(dǎo)PBMC凋亡通路和p53信號通路(包括CTSL、CTSB、CTSD、TNFSF10、NTRK1、CCNB1、CCNB2、STEAP3和TP53I3)的激活，可能是包括患者PBMC在內(nèi)的各種類型免疫細(xì)胞減少的原因，提示SARS-CoV-2感染可經(jīng)p53信號通路的激活這一潛在毒性作用機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)性免疫炎性損傷效應(yīng).新近一項回顧性隊列研究揭示COVID-19死亡患者的D-二聚體、鐵蛋白、LDH和IL-6等血生化指標(biāo)隨病情惡化有明顯升高，提出SARS-CoV-2感染介導(dǎo)的炎性損傷致病機(jī)制可能是COVID-19發(fā)病的重要原因[66].其中，鐵蛋白作為機(jī)體鐵儲存的生物標(biāo)志，其耗竭會導(dǎo)致細(xì)胞鐵的蓄積，而過量的鐵負(fù)荷可通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡；此外，鐵蛋白的選擇性自噬降解過程，通過調(diào)節(jié)鐵元素儲備穩(wěn)態(tài)也參與調(diào)控細(xì)胞鐵死亡[67].該結(jié)果提示SARS-CoV-2感染介導(dǎo)的免疫炎性損傷可能與鐵死亡這一新型細(xì)胞死亡形式有關(guān).

以上研究為揭示ICD等細(xì)胞死亡形式參與SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)的機(jī)體毒性損傷過程提供了依據(jù).目前，對SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡模式關(guān)聯(lián)的毒性損傷機(jī)制仍知之甚少，其是否經(jīng)ICD(如焦亡)產(chǎn)生大量的DAMPs(如CCL2/3/4和IL-6/18等)引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，進(jìn)而被全身免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞)識別并引發(fā)強烈的免疫炎癥反應(yīng)，對于理解SARS-CoV-2感染的毒性作用機(jī)制至關(guān)重要.進(jìn)一步確定不同的RCD信號通路和獨特的效應(yīng)分子(如細(xì)胞焦亡中的Caspase-1、NLRP3和IL-1β等)，研究細(xì)胞死亡過度或缺乏在人類疾病中的毒性作用機(jī)制[58]，將為COVID-19靶向干預(yù)和治療的臨床指導(dǎo)提供潛在靶點和有效評價依據(jù).

4 SARS-CoV-2感染與細(xì)胞器毒性作用及機(jī)制

細(xì)胞器數(shù)量、大小和位置的動態(tài)變化可介導(dǎo)各細(xì)胞器的質(zhì)量控制，并經(jīng)不同細(xì)胞器之間的膜接觸位點(MCSs)精密調(diào)控，參與細(xì)胞特定的生物學(xué)功能和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[68].因此，SARS-CoV-2感染誘發(fā)宿主細(xì)胞中的靶細(xì)胞器質(zhì)量控制失調(diào)，是其介導(dǎo)毒性作用發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)之一.

4.1 細(xì)胞膜系統(tǒng)動態(tài)

已知SARS-CoV入胞存在兩種方式：一種是S蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用形成胞內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞.S蛋白在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中，可經(jīng)內(nèi)體組織蛋白酶B(CatB) 和L(CatL)活化介導(dǎo)SARS-CoV包膜與內(nèi)體膜融合，從而向宿主細(xì)胞質(zhì)釋放病毒RNA，然后經(jīng)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制將新的病毒RNA轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器重新組裝[69].另一種是S蛋白依賴TMPRSS2在細(xì)胞膜表面剪切活化，導(dǎo)致SARS-CoV包膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜融合，介導(dǎo)病毒入胞[70].

與此一致地，Ou等[71]通過構(gòu)建SARS-CoV-2的S蛋白假病毒系統(tǒng)并穩(wěn)定轉(zhuǎn)化hACE2的人腎上皮細(xì)胞293T，證實SARS-CoV-2可通過膜融合和內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞.跨膜糖蛋白CD147與S蛋白相互結(jié)合的新途徑可介導(dǎo)病毒入侵Vero-E6細(xì)胞，以增強病毒復(fù)制并導(dǎo)致細(xì)胞活力下降[72].上述結(jié)果提示SARS-CoV-2感染可經(jīng)多重分子互作途徑，通過細(xì)胞膜入胞，介導(dǎo)靶細(xì)胞器毒性作用.

4.2 線粒體質(zhì)量控制(MQC)與信號通訊

線粒體作為細(xì)胞代謝調(diào)控的樞紐，MQC紊亂一直被作為環(huán)境因素誘導(dǎo)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)的毒性評價關(guān)鍵指標(biāo).最近，Court等[73]基于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞模型，以及急性移植物抗宿主病的動物模型，發(fā)現(xiàn)當(dāng)宿主發(fā)生感染時，為了抑制機(jī)體過度活躍的免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)，MSCs會將線粒體直接轉(zhuǎn)移給T細(xì)胞，通過激發(fā)線粒體-細(xì)胞核逆行信號通訊促進(jìn)叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子P3(FOXP3)、白介素2受體α(IL2RA)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA4)和TGFB等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活化和細(xì)胞重編程，提示MSCs調(diào)控T細(xì)胞重編程的線粒體療法對于免疫關(guān)聯(lián)性疾病的控制具有重要作用.Fan等[35]發(fā)現(xiàn)男性病例的睪丸細(xì)胞是SARS-CoV-2感染的潛在靶點，可引起病毒性睪丸炎；隨后，一項在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平研究成人睪丸組織ACE2基因表達(dá)模式的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACE2陽性的間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞中，細(xì)胞連接和免疫相關(guān)基因(如ACE2、CTNNA1和KPNB1)上調(diào)，MQC和生殖相關(guān)基因(如MRPS18A、QRSL1、COA3、MTOL和RCC1L)下調(diào)，進(jìn)一步提示MQC介導(dǎo)的細(xì)胞核通訊可能參與SARS-CoV-2感染介導(dǎo)的宿主免疫關(guān)聯(lián)性生殖毒性[48].這些結(jié)果為利用線粒體治療SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)的細(xì)胞器毒性損傷提供了新思路.

4.3 溶酶體降解作用

溶酶體是細(xì)胞內(nèi)代謝廢物和受損細(xì)胞器等的終末降解站，作為控制細(xì)胞代謝和質(zhì)量控制的新型細(xì)胞信號平臺，是產(chǎn)生并執(zhí)行下游反應(yīng)的動態(tài)樞紐.研究發(fā)現(xiàn)，給予溶酶體膜鈣離子通道蛋白TPC2抑制劑粉防己堿干預(yù)后，可抑制SARS-CoV-2的S蛋白假病毒顆粒入胞，提示溶酶體質(zhì)量控制可能參與SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷[71].因此，靶向溶酶體質(zhì)量控制(如氯喹降低溶酶體酸性環(huán)境)以緩解SARS-CoV-2感染介導(dǎo)機(jī)體毒性作用損傷的相關(guān)臨床方案已相繼開展，并取得一定成效.Wang等[74]通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，氯喹(半數(shù)有效濃度(EC50)=1.13 μmol/L，細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(CC50)>100 mmol/L，安全指數(shù)(SI)>88.50)可在低微摩爾濃度下有效地阻斷病毒感染Vero-E6細(xì)胞.鐘南山研究團(tuán)隊[75]的多中心前瞻性觀察研究結(jié)果顯示，與對照組相比，氯喹組患者的病毒RNA可被更快檢出(中位數(shù)的絕對差為-6.0 d)，發(fā)燒時間較短；并且在第10天和第14天，氯喹組檢測不到病毒RNA的患者比例(分別為91.4%和95.9%)高于對照組(分別為57.4%和79.6%)，因此提出氯喹可以作為防治COVID-19大流行的一種經(jīng)濟(jì)有效藥物.但Geleris等[76]發(fā)現(xiàn)氯喹并不能降低COVID-19患者使用機(jī)械通氣的風(fēng)險.因此，基于研究對象年齡、基礎(chǔ)疾病等呈現(xiàn)的個體差異性，仍需進(jìn)行更有效的多中心前瞻性隨機(jī)試驗，以解釋和驗證氯喹對COVID-19病程中SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)溶酶體損傷的毒性作用機(jī)制，進(jìn)一步完善靶向溶酶體干預(yù)的臨床方案.

4.4 細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控

細(xì)胞核作為細(xì)胞遺傳與代謝調(diào)控中樞，外源環(huán)境因素暴露可通過直接作用于順式作用元件和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等影響基因表達(dá)調(diào)控.研究表明，當(dāng)宿主細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂時，細(xì)胞核膜會暫時解體，有利于RNA和DNA病毒進(jìn)入核內(nèi)并依賴宿主核蛋白進(jìn)行復(fù)制[77].如流感病毒、乙肝病毒等可通過宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP1和p53等激活，啟動“瀑布式”炎癥級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)促炎趨化因子和細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6等)分泌，最終導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴[78].類似地，Huang等[7]研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染可引起宿主血漿中IL-1β、TNF-α和IL-6等27種細(xì)胞因子水平的顯著升高，并與宿主毒性損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示細(xì)胞核介導(dǎo)的炎性基因表達(dá)失調(diào)參與影響細(xì)胞因子風(fēng)暴所誘導(dǎo)的毒性損傷.

4.5 多細(xì)胞器間通訊網(wǎng)絡(luò)

細(xì)胞器質(zhì)量控制和病毒感染之間存在密切的關(guān)系，因此，在分子和細(xì)胞器層面探討病毒感染與細(xì)胞功能的聯(lián)系有助于闡明病毒致病機(jī)制.SARS-CoV-2感染從入胞、胞內(nèi)發(fā)揮功能到出胞的一系列過程中，是否經(jīng)多細(xì)胞器網(wǎng)絡(luò)精密調(diào)控參與細(xì)胞器毒性介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用損傷尚未可知.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，生物因素暴露(如HBV感染)可識別鈉離子-牛磺膽酸-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白入胞，經(jīng)環(huán)氧化酶2(COX-2)、Bcl-2 相互作用蛋白3類蛋白(BNIP3L)等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)信號分子介導(dǎo)細(xì)胞器(如線粒體、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)穩(wěn)態(tài)質(zhì)量控制，參與多細(xì)胞通訊調(diào)控肝細(xì)胞代謝重編程和RCD(如壞死性凋亡和焦亡等)，介導(dǎo)細(xì)胞PAMPs和(或)DAMPs釋放，影響肝臟區(qū)域免疫失調(diào)關(guān)聯(lián)性肝毒性損傷，提示多細(xì)胞器質(zhì)量控制網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)在生物因素暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷中發(fā)揮重要作用[79-81].另有研究表明病毒感染可通過改變線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)滿足病毒復(fù)制過程的需要[82].人巨細(xì)胞病毒感染經(jīng)UL37x1蛋白介導(dǎo)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入線粒體，以誘導(dǎo)人原代成纖維細(xì)胞的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，調(diào)節(jié)線粒體動態(tài)依賴性細(xì)胞凋亡[83].柯薩奇病毒2B蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞HeLa中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體之間的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少，從而抑制細(xì)胞凋亡[84].上述結(jié)果提示線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持對于各種病毒感染的細(xì)胞功能至關(guān)重要.前期研究還發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV病毒ORF-9B蛋白的表達(dá)可誘導(dǎo)線粒體動力相關(guān)蛋白1(Drp1)泛素化，促進(jìn)HEK293細(xì)胞的線粒體融合和溶酶體功能增強，有助于逃避宿主的先天免疫[85].在SARS-CoV感染誘導(dǎo)的Vero-6E細(xì)胞凋亡過程中，觀察到高爾基體呈現(xiàn)過度片段化[86].因此，SARS-CoV-2可能與SARS-CoV感染相類似，可經(jīng)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等之間多細(xì)胞器網(wǎng)絡(luò)的精密調(diào)控，參與介導(dǎo)細(xì)胞器毒性作用損傷.最近一項研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2感染可通過線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三磷酸肌醇受體介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+信號轉(zhuǎn)運，影響線粒體功能[87].這些結(jié)果都為細(xì)胞器交互作用網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控SARS-CoV-2感染介導(dǎo)的宿主細(xì)胞毒性損傷和轉(zhuǎn)歸提供了線索.

目前，SARS-CoV-2感染是否和如何由不同特定細(xì)胞器間通訊和信號調(diào)控，經(jīng)細(xì)胞外囊泡形成途徑(如外泌體)參與SARS-CoV-2裝載和運輸，尚未見報道.有研究發(fā)現(xiàn)，登革病毒感染的人肝癌Huh7細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜呈現(xiàn)內(nèi)陷，形成含有雙鏈RNA的囊泡[88]；SARS-CoV感染可誘導(dǎo)Vero-6E細(xì)胞形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的雙層膜囊泡，介導(dǎo)病毒復(fù)制和細(xì)胞間傳播[89-90].因此，針對COVID-19病理損傷進(jìn)程的多細(xì)胞器靶向干預(yù)機(jī)制，以及其他細(xì)胞器衍生細(xì)胞外囊泡靶向干預(yù)機(jī)制的毒理學(xué)探索，是當(dāng)前開展毒性評價的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有助于為COVID-19臨床防治方案的制定和作為損傷早期標(biāo)志提供毒性評價依據(jù).

綜上，SARS-CoV-2感染在細(xì)胞器、細(xì)胞、靶器官、個體/群體等毒性作用級聯(lián)中的相關(guān)信號通路分子模式及其誘導(dǎo)宿主炎性損傷表型的已有研究進(jìn)展(表1)，為SARS-CoV-2感染的關(guān)鍵毒性通路、早期生物標(biāo)志篩查和靶向干預(yù)提供了線索.現(xiàn)有的靶向干預(yù)方式主要如下：1) SARS-CoV-2疫苗等;2) 抗炎治療,如IL-6受體單克隆抗體等;3) 抗病毒治療,如干擾素β-1b+洛匹那韋+利巴韋林聯(lián)合用藥等;4) 細(xì)胞器靶向治療,如氯喹/羥氯喹、粉防己堿等.

表1 SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)宿主炎性損傷的毒性作用表型和信號分子級聯(lián)Tab.1 Cascades of toxicological phenotypes and signaling molecules induced by SARS-CoV-2 infection in host inflammatory injuries

5 SARS-CoV-2感染的毒性檢測和干預(yù)評價的新技術(shù)與展望

前期大量針對SARS或MERS等高致病病毒的體內(nèi)外毒理學(xué)實驗研究表明，SARS或MERS依賴于S蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞膜ACE2受體結(jié)合入胞，引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致宿主細(xì)胞、組織和器官級聯(lián)毒性損傷.已有靶向病毒入胞的單克隆抗體藥物、抗病毒融合肽和小分子抑制劑等的設(shè)計，可為人類快速認(rèn)識和早期干預(yù)SARS-CoV-2提供理論基礎(chǔ)[94-95].同時，不同病毒間的差異(如SARS-CoV與SARS-CoV-2的異同)以及病毒本身存在的抗原漂移和耐藥突變等問題，使得應(yīng)對新型病毒或未知病毒的個體感染和人群傳播流行等突發(fā)事件時面臨巨大挑戰(zhàn)，也對新型病毒感染的早期識別、診斷、監(jiān)測和有效干預(yù)等疾病防控的新技術(shù)和新方法提出了更高要求.

傳統(tǒng)毒理學(xué)毒性檢測體系已應(yīng)用于SARS-CoV感染致病和人群感染的毒性作用機(jī)制和轉(zhuǎn)化毒理學(xué)研究[96-97].現(xiàn)代毒理學(xué)的快速發(fā)展使傳統(tǒng)毒理學(xué)檢測融合多學(xué)科新型研究工具和手段，實現(xiàn)了從整體水平向細(xì)胞和分子水平的雙向飛躍，可為人們理解SARS-CoV-2生命周期和致病性開辟新的研究途徑.因此，針對COVID-19患者生物樣本進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組等多維組學(xué)的分析應(yīng)用，可以使毒理學(xué)從SARS-CoV-2感染的組織細(xì)胞中少數(shù)靶點的檢測，發(fā)展到動物或人群生物樣品全基因組、蛋白表達(dá)譜和分子網(wǎng)絡(luò)、代謝產(chǎn)物的測定.整合利用冷凍電鏡技術(shù)平臺、生物信息學(xué)及計算毒理學(xué)等新平臺，也將有助于提升系統(tǒng)毒理學(xué)在SARS-CoV-2感染的毒性效應(yīng)監(jiān)測、毒性作用靶點發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用領(lǐng)域的價值.

基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展使細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物模型的建立有了快速簡便的方法，毒理學(xué)3R(替代、減少、優(yōu)化)原則得到不斷優(yōu)化，為其對新發(fā)環(huán)境有害因素(如SARS-CoV-2感染)的毒性評價提供了技術(shù)支撐.Broughton等[95]建立了基于CRISPR-Cas12的DETECTR便攜式微流控技術(shù)，為半定量PCR提供了直觀、快速(<40 min)的替代方法，可在臨床診斷實驗室之外提供便攜式的SARS-CoV-2即時檢測.Tuan研究團(tuán)隊[96-97]利用基因編輯工具CRISPR-Cas13識別病毒特有的核酸特征，運用組織特異性啟動子驅(qū)動的Cas13d表達(dá)，實現(xiàn)了對COVID-19患者感染器官的靶向精確治療，提示該系統(tǒng)可作為一種簡單、靈活、快速的檢測、預(yù)防和治療RNA病毒感染的潛在方法，為確定清除SARS-CoV-2的毒理學(xué)安全性和有效性評價提供理論依據(jù).

綜上，面對SARS-CoV-2感染對現(xiàn)代毒理學(xué)中毒作用機(jī)制和毒理學(xué)安全性評價的挑戰(zhàn)，需立足于計算毒理學(xué)、高通量毒性測試、類器官培養(yǎng)、模式動物(如SARS-CoV-2感染模型和ACE2轉(zhuǎn)基因動物模型)、人工智能等新型技術(shù)手段和平臺的開發(fā)運用，聚焦于分析SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)細(xì)胞器、細(xì)胞、靶器官、個體和群體等不同層面的毒性作用級聯(lián)模式，探討其毒性作用的影響因素，闡明毒理學(xué)特征及其對機(jī)體的遠(yuǎn)期不良毒效應(yīng)，為SARS-CoV-2感染等新發(fā)環(huán)境生物因素誘發(fā)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的毒性損傷，及其早期生物標(biāo)志篩查和轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供線索和依據(jù).

致謝：感謝王攀、吳欣謀、吳自力、吳佳燊、杜澤邦和王偉華等參與本文的資料收集工作.