外源營養因子對巴爾喀什蘑菇菌絲的影響

羅 影，關永強，祁正祥，郝敬喆，努爾孜亞·亞力買買提，魏 鵬，賈文捷，賈培松

(1.新疆農業科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2. 新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002，3. 新疆農業大學，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】巴爾喀什蘑菇(AgaricusbalchaschensisSamgina & G. A. Nam)屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，蘑菇科(Agaricaceae)，蘑菇屬(Agaricus)，又稱焉耆黑蘑菇、博湖蘑菇、蘆葦蘑菇等，屬于中亞地區特有種，主要生長在內陸湖泊沿岸，蘆葦腐殖質豐富的沙灘上，常埋于沙層中。其子實體碩大，群生或散生，肉質緊實鮮嫩，風味獨特，營養豐富[1-3]。據報道，其子實體中粗蛋白質含量44.09%，粗脂肪含量2.07%，粗纖維含量10.89%，無氮浸出物含量32.27%，灰分含量10.68%，并含有17種氨基酸，其中7種為必需氨基酸[4,5]。前期試驗發現其野生子實體中還含有多糖、苷類、有機酸、酚類、鞣質類、甾體類、三萜類、黃酮類、內酯類、揮發油類等化學成分[6]。巴爾喀什蘑菇名副其實的是一種高蛋白、低脂肪、高纖維，并富含多種礦物質營養。影響食用菌生長發育的因素很多，碳源為其提供生長物質和代謝能量，營養需求關系中細胞的生長代謝需要碳源提供碳架和能量。氮源主要用于合成食用菌生長發育過程中生成的蛋白質、核酸等物質。礦質元素在維持細胞內滲透壓平衡，和作各種酶的激活因子與輔助因子中作用重大，若其供給異常，則會導致菌體形態及生理生化性質發生改變。除此之外，往培養基中添加一定量的維生素、核苷酸、植物生長調節劑也能調節菌體內酶活性，改變細胞膜通透性，促進菌體營養物質的攝取和特定蛋白的表達，調控食用菌的生殖生長[7-10]。開展外源營養因子對巴爾喀什蘑菇菌絲生長影響的研究，對于巴爾喀什蘑菇的馴化栽培具有重要的現實意義。【前人研究進展】劉玉芳[11-12]針對關鍵環境因子包括溫度、光照、pH和培養料含水量對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響進行了研究。張孔金[13]對野生巴爾喀什黑傘進行了分離鑒定及其生物學特性研究。郝敬喆[14]對野生巴爾喀什蘑菇的馴化栽培和漆酶活性進行了研究。【本研究切入點】目前對于無機鹽、維生素和植物生長調節劑等對巴爾喀什蘑菇菌絲生長影響鮮有報道。研究巴爾喀什蘑菇菌絲生長有影響的外源營養因子。【擬解決的關鍵問題】以新疆野生巴爾喀什蘑菇分離菌株為試材，采用單因素方法進行試驗，分析不同外源營養因子，包括碳源、氮源、培養料、無機鹽、維生素和植物生長調節劑，對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響為優質栽培和產業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

巴爾喀什蘑菇菌株為新疆農業科學院植物保護研究所保藏。

1.1.2 培養基

基礎培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀3 g，無水硫酸鎂1.5 g，瓊脂20 g，pH自然。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL ，pH自然。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化

將低溫保藏的巴爾喀什蘑菇菌種接種到PDA平板培養基上，25℃恒溫黑暗培養，待菌絲長滿平板備用。

1.2.2 平板實驗法

每個平皿中央定量接種直徑5 mm的巴爾喀什蘑菇菌絲塊，25℃恒溫黑暗培養，測定不同外源因子對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響，主要以菌絲生長速度為指標，同時觀察菌落的形態特征、菌絲長勢、菌落色澤等，所有試驗均采用90 mm的培養皿，培養基用量20 mL/皿[15,16]。

1.2.3 碳源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實驗法，固定基礎培養基中的碳素含量，碳源更換為與葡萄糖等量碳素的果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、可溶性淀粉等8個碳源，以無糖培養基為對照，每個處理5個重復。研究不同碳源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.4 氮源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實驗法，固定基礎培養基中的氮素含量，氮源更換為與蛋白胨等量氮素的有機氮源(牛肉膏、牛肉粉、酵母浸粉、酵母膏、酸水解酪蛋白、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸鹽酸鹽、苯丙氨酸、甲硫氨酸)和無機氮源(硫酸銨、草酸銨、氯化銨、檸檬酸銨、酒石酸銨、硝酸鉀、尿素)，以無氮培養基為對照，每個處理5個重復，研究不同氮源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.5 培養料對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實驗法，在PDA培養基基礎上添加等量常見培養料，篩選適合巴爾喀什蘑菇培養的原種培養基，選擇食用菌栽培種常用的15種培養料，磨成粉末，過篩，加入到PDA培養基中，每個處理5個重復，以PDA培養基為對照，考察不同培養料對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.6 無機鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實驗法，在PDA培養基中加入不同比例的硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鈣、碳酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅，以PDA培養基為對照，每個處理5個重復，研究不同無機鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.7 維生素對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實驗法，在PDA培養基中加入不同比例的維生素B1(硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(煙酸)、維生素B5(泛酸)、維生素B6(吡哆醇類)、維生素H(生物素)、維生素B9(葉酸)、維生素B12(氰鈷胺素)、維生素B-h(肌醇)、維生素C(抗壞血酸)，以PDA培養基為對照，每個處理5個重復，研究不同維生素對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.2.8 植物生長調節劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

采用平板實驗法，在PDA培養基中加入不同比例的吲哚乙酸(IAA)、萘乙烯(NAA)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、6-糠氨基嘌呤(6-KT)、赤霉素、三十烷醇、腐植酸鈉，以PDA培養基為對照，每個處理5個重復，研究不同植物生長調節劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 碳源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，巴爾喀什蘑菇在8種碳源培養基上均能生長，但在不同碳源培養基上，菌絲生長有較大差異。以可溶性淀粉為碳源時，菌絲生長速度最快，達(1.40±0.04) mm/d，與對照和其他6種碳源存在顯著差異，且從菌絲濃密度和菌絲長勢上看，其菌絲最濃密，長勢最好。最佳碳源為可溶性淀粉，巴爾喀什蘑菇更容易利用多糖物質。表1，圖1

表1 不同碳源下巴爾喀什蘑菇菌絲生長變化Table 1 Effects of different carbon sources on the mycelial growth of Agaricus balchaschensis

2.2 氮源對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，巴爾喀什蘑菇在18種氮源培養基上均能生長，包括有機氮、氨基酸、無機氮化合物等，且不添加氮源時也能生長，但在不同氮源培養基上，菌絲生長有較大差異。其中以有機氮為氮源時菌絲相對濃密，菌絲長勢較好，且以酵母膏為氮源時，菌絲最為濃密粗壯，其次是酵母浸粉、牛肉膏、牛肉粉、蛋白胨，但對其生長速度影響差異不顯著，以酸水解酪蛋白為氮源時，生長速度最快，達(1.06±0.05)mm/d，無氮源和牛肉膏為氮源時次之；而以氨基酸和無機氮為氮源時，會抑制其菌絲濃密度。最佳氮源為牛肉膏。表2，圖2

表2 不同氮源下巴爾喀什蘑菇菌絲生長變化Table 2 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth of Agaricus balchaschensis

2.3 培養料對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，PDA培養基中加入培養料粉末，巴爾喀什蘑菇的菌絲濃密度顯著增強，菌絲生長速度也明顯加快，大多常見培養料均適合巴爾喀什蘑菇菌絲的生長。其中加入木屑粉和棉籽殼發酵料時，生長速度最快，與對照差異顯著，達1.75 mm/d。在加入營養土1、營養土2、木屑粉、蘆葦基質及棉籽殼發酵料的培養基上容易形成菌絲凝集，產生原基。培養巴爾喀什蘑菇較為合適的培養料有木屑、棉籽殼發酵料、麥草和蘆葦基質。表3，圖3

表3 不同培養料下巴爾喀什蘑菇菌絲生長變化Table 3 Effects of different culture medium on the mycelial growth of Agaricus balchaschensis

2.4 無機鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，不同無機鹽對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響效果有明顯差異。加入3種不同形式的Ca2+在低濃度時，對巴爾喀什蘑菇的生長起促進作用，之后隨著濃度升高，又表現出抑制作用。加入3種不同形式的Ca2+，均可明顯刺激巴爾喀什蘑菇菌絲發生凝結，形成原基。MgSO4和KH2PO4作為實驗室培養真菌常加入的無機鹽，對巴爾喀什蘑菇并未有促進作用，反而隨著濃度增加抑制作用明顯。MnSO4和FeSO4在低濃度時對巴爾喀什蘑菇的生長起促進作用，之后隨著濃度升高，又表現出抑制作用。ZnSO4和CuSO4的添加，在供試低濃度內對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長起抑制作用。圖4，圖5

2.5 維生素對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素H、維生素B9、維生素B-h和維生素C均能在一定范圍內促進巴爾喀什蘑菇的菌絲生長速率，維生素B3對其影響不大，而維生素B5和維生素B12有抑制作用。圖6

2.6 植物生長調節劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響

研究表明，供試植物生長調節劑對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長在一定范圍內均有一定的促進作用，IAA、NAA、6-BA、赤霉素均表現在濃度小于0.1 mg/L時，有促進作用，隨之濃度增大而表現為抑制作用；6-KT和腐殖酸鈉濃度小于0.8 mg/L時有促進作用，且濃度為0.6 mg/L時，促進作用最明顯；三十烷醇用95%乙醇溶解，對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響不明顯。圖7

3 討 論

巴爾喀什蘑菇是一種營養價值豐富的食用菌。目前該菌在實驗室已實現人工栽培[13-14]，但是存在菌絲生長周期長，原基形成不統一，轉化率低等問題，制約其栽培推廣和產業化生產[13-14]。研究從營養物質角度探究不同外源營養因子對巴爾喀什蘑菇菌絲生長的影響，以期為其優質栽培和產業化生產提供理論依據。

試驗結果表明，綜合菌絲長勢和生長速度，巴爾喀什蘑菇菌絲生長的最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為牛肉膏，而張孔金[13]研究其最佳碳氮源為葡萄糖和蛋白胨，郝敬喆[14]研究最佳碳氮源為麥芽糖和可溶性淀粉、硝酸銨和蛋白胨。該實驗差異可能與試驗菌株差異或基礎培養基成分差異有關，原因還需進一步研究。適合巴爾喀什蘑菇栽培的培養料有木屑、棉籽殼發酵料、麥草和蘆葦基質。PDA中加入不同無機鹽、維生素和植物生長調節劑，結果顯示ZnSO4和CuSO4在供試低濃度內對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長起抑制作用；MgSO4和KH2PO4作為實驗室培養真菌常加入的無機鹽，對巴爾喀什蘑菇并未有促進作用，反而隨著濃度增加抑制作用明顯；MnSO4、FeSO4、CaCl2、CaSO4和CaCO3在低濃度時對巴爾喀什蘑菇的生長起促進作用，之后隨著濃度升高，又表現出抑制作用。其中3種不同形式的鈣離子，均可明顯刺激巴爾喀什蘑菇菌絲發生凝結，形成原基，造成這一現象的原因有待進一步研究。另外，除維生素B3、三十烷醇對巴爾喀什蘑菇菌絲生長影響不明顯，維生素B5和維生素B12有抑制作用之外，其他供試的大多維生素和植物生長調節劑對巴爾喀什蘑菇菌絲生長均有促進作用。研究只對影響巴爾喀什蘑菇菌絲生長的碳源、氮源、培養料、無機鹽、維生素和植物生長調節劑進行了單因素分析，尚未進行復合組合優化，仍須進一步研究。

4 結 論

單因素平板法對新疆野生巴爾喀什蘑菇(Agaricusbalchaschensis)組織分離菌株進行試驗，添加不同外源營養因子，包括碳源、氮源、培養料、無機鹽、維生素和植物生長調節劑等，該菌菌絲生長的最佳碳、氮源為可溶性淀粉和牛肉膏，培養該菌較為合適的培養料有木屑、棉籽殼發酵料和蘆葦基質，無機鹽(MnSO4、FeSO4、CaCl2、CaSO4、CaCO3)，維生素(B1、B2、B6、H、B9、B-h、C)，及植物生長調節劑(IAA、NAA、6-BA、6-KT、赤霉素和腐殖酸鈉)，均可在一定程度上促進巴爾喀什蘑菇菌絲的生長。不同外源營養因子對巴爾喀什蘑菇菌絲的生長有不同程度的影響。