姜黃素固體分散體處方工藝優化及體外溶出度評價

陸 穎，徐子寒

（南京中醫藥大學附屬張家港醫院藥學部，江蘇 蘇州215600）

姜黃素（CUR）是從姜科植物（如姜黃、莪術、郁金）根莖中提取出的一種天然酚類物質，屬于二酮類化合物［1-2］，具有利膽、抗感染、抗病毒、抗氧化、抗凝血、調血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用［3-8］。但CUR的水溶性極低（僅為0.96μg/mL）［9］，且在胃腸道易發生葡萄糖醛酸轉移酶（UGTs）誘導的Ⅱ相代謝［10-11］，生物利用度極低，極大地限制了其開發應用。胡椒堿（PIP）是胡椒科植物胡椒和蓽菝中的一種酚類活性物質［12-13］，也屬水難溶性藥物，25℃下溶解度僅為22.34μg/mL［14-15］。此外，PIP為肝臟和腸內UGTs抑制劑，可有效抑制藥物UGTs誘導的Ⅱ相代謝。PIP可抑制CUR的UGTs代謝，兩者聯用，具有協同作用，可降低對脂質的攝取，解決肥胖問題［16］；有效降低大腦神經中炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及凋亡因子caspase-3水平，減少抑郁癥狀的發生，增強神經保護作用［17］；治療潰瘍性結腸炎療效顯著［18］；可抑制乳腺癌細胞的自我更新，且對正常細胞無毒副作用［19］，起到防癌、抗癌作用；可減輕DNA損傷和神經毒性，增強免疫作用［20］。將難溶性藥物制備成固體分散體（SD）是改善藥物溶解度、溶出度及生物利用度的常用方法［21-22］。本研究中選擇CUR與PIP的臨床常用配比（3∶1，m/m）的藥物組合物，利用溶解度參數，篩選出與CUR和PIP 2種藥物相容性均良好的載體；通過溶劑法，制備姜黃素固體分散體（CUR SD）；根據CUR與PIP 2種藥物的溶出度，進一步優選出最佳載體及藥物與載體的比例；通過差示掃描量熱分析（DSC）法、X-射線粉末衍射分析（XRPD）法、傅立葉紅外光譜（FTIR）法對制備的CUR SD進行表征，并測定CUR與PIP的溶解度與溶出度，以評價CUR與PIP溶解度與溶出度的改善情況?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010A HT型高效液相色譜儀、IRTracer-100型紅外光譜儀（日本Shimadzu公司）；XP/XS型微量分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；Milli-Q型超純水系統（美國Millipore公司）；D8 Advance型X-射線粉末衍射儀（德國Bruker公司）；Q2000型示差掃描量熱儀（美國TA公司）；HY68/RCY-1型智能溶出試驗儀（北京中西遠大科技有限公司）；SNE-4500型掃描電鏡（日本Hitachi公司）；MXS1100型渦旋混合儀（美國賽洛捷克公司）；KH500DE型超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

姜黃素對照品（批號為110823-201405，純度為98.9%）、胡椒堿對照品（批號為110775-201405，純度為98.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；姜黃素原料藥（批號為BD9137，純度＞98%，上海畢得醫藥科技有限公司）；胡椒堿原料藥（批號為91197C，純度＞98%，上海泰坦科技股份有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30）、聚乙烯吡咯烷酮BS630（PVP S630），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羥丙基纖維素（HPC）、羥丙基甲基纖維素（HPMC），均購自上海賢鼎生物科技有限公司；鹽酸（分析純），乙腈、甲醇（色譜純），均購自國藥集團化藥試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、吐溫-80、磷酸二氫鉀（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 CUR SD分析方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.5%磷酸溶液（60∶40，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10μL；檢測波長：342 nm（PIP），425 nm（CUR）。

2.1.2 線性關系考察

取CUR對照品5.205 mg、PIP對照品5.185 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）使溶解，即得CUR對照品貯備液（質量濃度為208.2μg/mL）和PIP對照品貯備液（質量濃度為207.4μg/mL）。吸取適量上述溶液，分別逐級稀釋0，2，4，8，16，32，64倍，按擬訂色譜條件進樣測定。分別以CUR與PIP對照品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果，CUR的回歸方程為YC＝83 480 XC＋82 499（R2＝0.999 9），線性范圍為3.25～208.20μg/mL；PIP的回歸方程為YP＝67 359 XP＋62 547（R2＝0.999 9），線性范圍為3.24～207.40μg/mL。

2.2 CUR SD的載體優選

2.2.1 藥物與載體相容性研究

只有藥物與載體間的相容性良好，才能形成性質穩定的SD。選用基團貢獻法，采用Molecular Modeling Pro分子模型預測軟件，計算CUR和PIP及不同載體的Hansen溶解度參數（δ），分析CUR和PIP與載體間的相容性。當藥物與載體溶解度參數差（Δδ＜7 MPa1/2）時，藥物和載體相容性良好；當Δδ＞10 MPa1/2時，藥物與載體相容性差［23-24］。分析結果見表1，根據溶解度參數計算結果，初步篩選的載體有PVP K30，PVP S630，HPC，HPMC。

表1 姜黃素和胡椒堿及各高分子載體的溶解度參數Tab.1 Solubility parameters of CUR，PIP and other polymer carriers

2.2.2 載體篩選

根據2.2.1項下計算結果，取上述4種載體，采用溶劑法制備CUR-PIP聚合物三元固體分散體（CURPIP-PVP K30 SD，CUR-PIP-PVP S630 SD，CURPIP-HPC SD，CUR-PIP-HPMC SD）。按藥物［CURPIP（3∶1，m/m）］與載體（PVP K30，PVP S630，HPC，HPMC）質量比為1∶3，加入無水乙醇，使CUR和PIP及載體溶解。通過旋轉蒸發除去溶劑（45℃），真空干燥過夜，研成細粉，過60目篩，制備得不同載體的CUR SD。以不同SD中CUR和PIP的累積溶出率為考察指標，進一步優選載體。為模擬人體胃腸道生理環境，選擇4種不同溶出介質［0.5%吐溫-80的鹽酸溶液（pH 1.2），含0.5%吐溫-80的醋酸鹽緩沖液（pH 4.5），含0.5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和含0.5%吐溫-80的水］考察CUR SD的溶出行為，介質體積為900 mL，溫度為37℃，轉速為50 r/min，平行操作3份，分別于5，10，15，20，30，45，60 min時取樣5 mL（隨即補足等溫度等量的溶出介質），經0.45μm微孔濾膜濾過。按擬訂色譜條件測定，計算各時間點CUR和PIP的累積溶出率，結果見圖1和圖2?？梢?，在4種不同溶出介質中，以PVP K30為載體制備的SD中CUR及PIP都在5 min時就已基本全部溶出，溶出速率明顯優于用其他3種載體（PVP S630，HPC，HPMC）制備的CUR SD，故選擇PVP K30為載體制備CUR SD。

圖1 姜黃素與不同載體在不同溶出介質中的溶出曲線（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.1 Dissolution profile of curcumin with different polymer carriers in different dissolution medium（n＝3）

圖2 胡椒堿與不同載體在不同溶出介質中的溶出曲線（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.2 Dissolution profile of piperine with different polymer carriers in different dissolution medium（n＝3）

2.3 藥物與載體比例的篩選

以PVP K30為載體，采用溶劑法制備SD。選擇藥物［CUR-PIP（3∶1，m/m）］與載體質量比1.5∶1，1∶1.5，1∶3比例，加入無水乙醇使CUR，PIP，PVP K30溶解。旋轉蒸發除去溶劑（45℃），真空干燥過夜，研成細粉，過60目篩，得到3種比例的CUR SD（1∶3，1∶1.5，1.5∶1，m/m）。考察不同比例CUR SD在上述4種溶出介質中的累積溶出率，介質體積為900 mL，溫度為37℃，轉速為50 r/min，平行操作3份，分別于5，10，15，20，30，45，60 min時取樣5 mL（隨即補足等溫度等量的溶出介質），經0.45μm微孔濾膜濾過。結果見圖3和圖4?？梢姡煌壤腟D中CUR及PIP的溶出速率均比原料藥快，而PVP K30比例越大，溶出速率越快。因在不同溶出介質中的藥物溶出行為相似，故選擇含0.5%吐溫-80 pH 1.2鹽酸溶液中的溶出結果進行分析。5 min時，不同比例的CUR SD中CUR的溶出速率分別為CUR原料藥的6.51，4.24，2.78倍，PIP的溶出速率分別為PIP原料藥的4.33，3.73，3.05倍。與CUR和PIP原料藥相比，不同比例的CUR SD均有較好的溶出度，溶出速率為CUR SD（1∶3，m/m）＞CUR SD（1∶1.5，m/m）＞CUR SD（1.5∶1，m/m），故選擇CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）進行下一步研究。

2.4 CUR SD的表征

2.4.1 差式掃描量熱分析（DSC）法

取樣品4～8 mg，置鋁坩堝中。測試條件：氮氣流速為50 mL/min；升溫速 率為10℃/min；升溫范圍為25～200℃。分別對CUR原料藥、PIP原料藥、PVP K30、2種比例的藥物（1∶3，1∶1.5，m/m）與PVP K30物理混合物及2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）進行熱力學分析，結果見圖5。可見，CUR與PIP原料藥分別在183.1℃與129.9℃處吸熱峰尖銳，該峰為CUR與PIP的熔點特征峰，表明CUR與PIP原料藥以晶體形式存在。PVP K30無尖銳吸熱峰，表明其以無定型形式存在；2種比例的物理混合物盡管在CUR與PIP對應的熔點處無晶體特征吸收峰，但物理混合物（1∶3，m/m）和物理混合物（1∶1.5，m/m）分別在118.0℃和120℃附近各有1個吸熱峰，推測在2種比例的物理混合物中，CUR與PIP發生了低共熔；而CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）中CUR及PIP的熔點特征峰均消失，證實CUR與PIP以無定型形式分散在PVP K30中。

圖3 不同比例姜黃素固體分散體中姜黃素在不同溶出介質中的溶出曲線（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.3 Dissolution profile of curcumin in CUR SD with different proportion in different dissolution medium（n＝3）

圖4 不同比例姜黃素固體分散體中胡椒堿在不同溶出介質中的溶出曲線（n＝3）A.Hydrochloric acid solution（pH 1.2）B.Acetate buffer solution（pH 4.5）C.Phosphate buffer solution（pH 6.8）D.Aqueous solutionFig.4 Dissolution profile of piperine in CUR SD with different proportion in different dissolution medium（n＝3）

2.4.2 X-射線粉末衍射分析（XRPD）法

測定條件：Cu靶為40 kV，40 mA；步長為0.02°；掃描速度為2°/min；掃描范圍為3°～40°（2θ）。分別對CUR原料藥、PIP原料藥、PVP K30、2種比例的藥物（1∶3，1∶1.5，m/m）與PVP K30物理混合物及2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）進行分析，結果見圖6。可見，CUR原料藥在7.8°，8.7°，14.4°，15.8°，17.2°，21.0°，23.2°，23.6°，24.6°，25.5°，26.6°，28.1°處有較強的晶體衍射峰；PIP原料藥在12°～30°有多個較強晶體衍射峰，表明CUR和PIP原料藥以晶體形式存在；PVP K30在3°～40°間無特征衍射峰，表明PVP K30為無定型載體；藥物與PVP K30的物理混合物中，盡管衍射峰強度減弱，但仍存在多個CUR及PIP原料藥的衍射峰，表明簡單混合不會改變藥物晶型狀態；CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）中，CUR和PIP的晶體衍射峰消失，表明CUR與PIP以無定型狀態分散在PVP K30中，與DSC法結果相符，成功制備成無定型CUR SD。

圖5 差示掃描量熱分析圖a.CUR API b.PIP API c.PVP K30 d.Physical mixture（1∶3，m/m）e.Physical mixture（1∶1.5，m/m）f.CUR SD（1∶3，m/m）g.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.5 DSC analysis diagram

2.4.3 傅立葉紅外光譜分析（FTIR）法

分別取CUR原料藥、PIP原料藥、PVP K30、2種比例的藥物（1∶3，1∶1.5，m/m）與PVP K30物理混合物及2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）適量，置紅外光譜儀中分析，波長范圍為400～4 000 cm-1，結果見圖7。可知，CUR原料藥的主要特征吸收峰有：3 502 cm-1處為—OH伸縮振動，1628cm-1處為C＝O伸縮振動［25］；PIP原料藥在1 710 cm-1處附近有C＝O特征峰［26］；PVP K30在3 453 cm-1處有O—H伸縮振動峰，在1 662 cm-1處有C＝O伸縮振動峰；2種物理混合物中，藥物及載體的特征峰仍存在，表明2種藥物與PVP K30未發生相互作用；CUR SD中CUR的—OH特征峰變寬，C＝O振動峰消失，PIP在1 710 cm-1處的C＝O特征峰減弱，可能是由于藥物與PVP K30間發生了分子間氫鍵的相互作用，氫鍵能通過抑制相轉變和重結晶來提高SD的穩定性，穩定SD中藥物的存在狀態［27］。

圖6 X-射線粉末衍射分析圖a.CUR API b.PIP API c.PVP K30 d.Physical mixture（1∶3，m/m）e.Physical mixture（1∶1.5，m/m）f.CUR SD（1∶3，m/m）g.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.6 XRPD analysis diagram

圖7 傅立葉紅外光譜分析圖a.CUR API b.PIP API c.PVP K30 d.Physical mixture（1∶3，m/m）e.Physical mixture（1∶1.5，m/m）f.CUR SD（1∶3，m/m）g.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.7 FTIR analysis diagram

2.4.4 掃描電鏡（SEM）分析

采用SNE-4500型掃描電鏡觀察CUR原料藥、PIP原料藥及2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）的表面形貌。樣品均勻撒于貼有導電膠帶的樣品座上，噴金5 min，用干凈鑷子取出，置SEM儀器內，采用3 kV的加速電壓掃描其表面，并進行拍照，結果見圖8。可見，CUR原料藥具有明顯的晶形特征，呈規則的柱狀結構；PIP原料藥多呈大小不一的橢球狀；而2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）呈不規則塊狀、顆粒狀，CUR的柱狀特征和PIP的橢球形特征已完全消失。

圖8 掃描電鏡圖A.CUR API B.PIP API C.CUR SD（1∶3，m/m）D.CUR SD（1∶1.5，m/m）Fig.8 SEM photographs

2.5 溶解度測定

分別加入含0.5%吐溫-80的鹽酸溶液（pH 1.2）、含0.5%吐溫-80的醋酸鹽緩沖液（pH 4.5）、含0.5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）和含0.5%吐溫-80的水等4種溶出介質置15 mL離心管中，分別稱取過量的CUR與PIP原料藥、2種比例原料藥（1∶3，1∶1.5，m/m）與PVP K30物理混合物、2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m），置空氣搖床中，37℃下振搖24 h，取出，平衡，取上清液2 mL，經0.45μm微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件測定，結果見表2。在不同溶出介質中，CUR和PIP原料藥的溶解度差異不大，2種比例PM中CUR和PIP的溶解度均大于原料藥，表明PVP K30可能具有一定的助溶效果；與CUR和PIP原料藥相比，2個CUR SD中的CUR和PIP的溶解度顯著提高（P＜0.01）。如在pH 1.2緩沖液中，與原料藥相比，物理混合物（1∶3，m/m）和物理混合物（1∶1.5，m/m）中CUR的溶解度提高至1.71倍和1.96倍，PIP溶解度提高至1.24倍和1.32倍，可能是PVP K30為親水性載體，使得藥物潤濕性增強，增加了藥物的溶解度；CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）中，CUR的 溶解度提高至4.18倍和3.92倍（P＜0.01），PIP溶解度也提高至2.13倍和1.94倍（P＜0.01），表明將PVP K30與CUR和PIP組合物共同制備成無定型CUR SD，可顯著提高CUR和PIP的溶解度。

表2 不同樣品中姜黃素和胡椒堿的溶解度（μg/mL，n＝3）Tab.2 Solubility of curcumin and piperine in different samples（μg/mL，n＝3）

2.6 體外溶出試驗

為了考察不同樣品的累積溶出率，精密稱取CUR原料藥、PIP原料藥、2種比例物理混合物及CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m），按2015年版《中國藥典（四部）》通則0931溶出度與釋放度測定法進行體外溶出試驗，以含0.5 %吐溫-80的鹽酸溶液（pH 1.2）為溶出介質，轉速為50 r/min，溶出介質體積為900 mL，溫度為37℃，分別于5，10，15，20，30，45，60 min時取樣5 mL，并隨即補足等溫度等量的溶出介質，經0.45μm微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件測定，分別記錄峰面積，計算出各時間點CUR和PIP的累積溶出率。結果見圖9。與CUR和PIP原料藥及2種比例物理混合物相比，CUR SD中CUR和PIP的累積溶出率和溶出速率均顯著提高。5 min時，CUR SD（1∶3，m/m）中CUR與PIP的累積溶出率分別達78.21%與73.32%，CURSD（1∶1.5，m/m）中CUR與PIP的溶出率分別為65.58%和54.03%；物理混合物（1∶3，m/m）中CUR與PIP的溶出率為10.31%和14.65%，物理混合物（1∶1.5，m/m）中CUR與PIP的溶出率分別為5.42%和13.95%；CUR原料藥及PIP原料藥累積溶出率僅為2.75%和17.64%。表明制備為CUR SD后，CUR及PIP的累積溶出率和溶出速率均顯著提高，CUR SD（1∶3，m/m）累積溶出率和溶出速率優于CUR SD（1∶1.5，m/m）。

圖9 溶出曲線圖（n＝3）A.Curcumin B.PiperineFig.9 Dissolution profile（n＝3）

3 討論

CUR的水溶性極低，屬生物藥劑學分類（BCS）Ⅳ類藥物，在胃腸道發生UGTs的Ⅱ相代謝，極大限制了CUR的生物利用度。但CUR具有多種藥理活性，臨床應用潛力較大，亟需改善生物利用度。PIP難溶于水，生物利用度也較差，但已被證實作為藥物生物利用度增強劑廣泛使用，可抑制參與藥物代謝的酶，減緩藥物體內的代謝；誘導胃腸道膜動力學改變，促進藥物快速吸收。本研究中將CUR和PIP配伍使用，通過固體分散技術，改善2種藥物的溶解度及溶出速率，同時抑制CUR的體內代謝，達到改善2種藥物在體內吸收的目的。此外，CUR與PIP聯用，可發揮協同治療的優勢，改善藥物臨床應用的缺陷。

本研究中首先根據CUR和PIP與不同聚合物載體的溶解度參數進行模擬分析，選擇與CUR和PIP相容性均較好的載體，通過溶劑法制備CUR SD，以溶出率為指標，最終確定PVP K30為制備CUR SD的最佳載體。進一步篩選藥物與載體比例時發現，3種不同比例的聚合物固體分散體溶出速率較原料藥均有增加，其中2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）的溶出速率較快，而CUR SD（1.5∶1，m/m）的溶出速率相對較差。結合溶解度測定結果，選擇CUR SD（1∶3，m/m）和CUR SD（1∶1.5，m/m）進行下一步研究。

通過DSC和XRPD對制備的CUR SD進行表征分析，證實成功制備了CUR三元無定型SD。FTIR結果表明，藥物與PVP K30間可能發生分子間氫鍵相互作用，使CUR和PIP分散于PVP K30的網狀結構中，阻滯藥物重新聚集，發生重結晶［26-27］。2種比例CUR SD（1∶3，1∶1.5，m/m）在不同pH的緩沖液中飽和溶解度顯著增大，體外溶出速率也有明顯提高，其中CUR SD（1∶3，m/m）累積溶出度和溶出速率優于CUR SD（1∶1.5，m/m）。

綜上所述，將CUR和PIP組合物與PVP K30聯合制備成的CUR SD可有效改善CUR及PIP的溶出率和溶出速率，有助于提高2種難溶性藥物的生物利用度，擴展其臨床應用。本研究中針對CUR的理化性質及應用缺陷，有針對性地選擇PIP配伍使用，共同制備成三元無定型SD，為解決其他難溶性藥物的溶解度、生物利用度及聯合應用的問題提供了新的思路。