超高效液相色譜串聯質譜法同時測定走川骨刺酊中3種烏頭類生物堿含量*

龐小蓮，劉吉成，林 生，周成忠，曾海清

（1.廣西壯族自治區玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林537000；2.廣西壯族自治區南寧市食品藥品檢驗所，廣西 南寧530007；3.廣西實正藥業有限公司，廣西 玉林537000）

中成藥走川骨刺酊由天南星、水半夏、草烏等7味藥材經滲漉法提取而成，主要功效有活血祛瘀、通絡止痛，常用于瘀血阻滯所致骨痹（骨質增生癥），癥見關節疼痛或刺痛，痛處固定，活動不利，面色晦暗，唇舌紫暗，脈沉或細澀等。處方中主要藥材草烏的主要成分為二萜類生物堿，包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，既是有效成分又是毒性成分［1］。產地、采收時間和炮制方法不同時，藥材毒性成分含量存在較大差異［2-4］。成人口服純烏頭堿0.2 mg即可引起中毒，3～5 mg可致死［5-8］。本品雖為外用，但使用過程中若有不慎即可引起中毒。目前含有烏頭類藥材中成藥的研究中，多數僅規定了烏頭堿的含量限度［9-10］。為了保證產品質量及安全，本試驗中采用超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法同時測定走川骨刺酊中3種烏頭類成分含量，為產品的質量評價和質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色譜儀，Waters Xevo TQ-S型三重四極桿質譜儀（美國Waters公司）；LC/MS30-1-E型氮氣發生器（英國Domnick Hunter公司）；3K15型高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；XS-205DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500GDV型恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

走川骨刺酊（廣西實正藥業有限公司，批號分別為201408101，201407101，201503101，201608101，201611101，201612101，201612102，201612103，201703101，201705101）；烏頭堿對照品（批號為110798-201307，純度98.8%）、次烏頭堿對照品（批號為110720-201111，純度98.8%），新烏頭堿對照品（批號為110799-201106，純度98.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲酸均為色譜純，氨水、甲醇、鹽酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC? BEH C18柱［11］（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～4 min時90%A→60%A，4～4.5 min時60%A-90%A，4.5～6 min時90%A［11］；流速為0.25 mL/min［12］；進樣量為10μL；柱溫為35℃。

質譜條件：離子源模式為電噴霧離子源（ESI）、正離子模式，掃描類型為多反應監測（MRM），毛細管電壓1.8 kV。離子源溫度為100℃，錐孔氮氣流速為150 L/h，碰撞氣為氬氣，脫溶劑氣氮氣流速為650 L/h，脫溶劑氣溫度為350℃，四極桿作為質量分析器［13-14］。定性離子對、定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量見表1［15］。

表1 3種烏頭類生物堿MRM參數Tab.1 MRM parameters of three kinds of aconitum alkaloids

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取烏頭堿對照品9.31 mg、次烏頭堿10.65 mg，精密稱定，各置25 mL容量瓶中，取新烏頭堿10.30 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，均用甲醇溶解并定容，得單一對照品貯備液；分別精密量取0.125 mL，置同一50 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得。

供試品溶液：精密量取樣品5 mL，用0.1 mol/mL鹽酸調pH至3，渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，過MCX柱（規格為500 mg/6 mL，上樣前用甲醇、超純水各5 mL活化），上樣液，先用5 mL 0.1 mol/mL鹽酸洗脫，再分別加水、甲醇各5 mL洗脫，棄去洗脫液，最后用0.5%氨化甲醇15 mL洗脫，收集洗脫液置50℃水浴下以氮氣吹至近干，加0.1%甲酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）20 mL溶解，渦旋1 min，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，轉移至50 mL容量瓶中，用初始流動相定容，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，用初始流動相定容，經0.22μm有機濾膜濾過，即得。

陰性對照品溶液：按走川骨刺酊標準工藝，取走馬胎3.6 g，川芎3.2 g，紅杜仲、天南星、骨碎補、水半夏各2.6 g制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密量取2.2項下3種溶液，按擬訂試驗條件進樣測定。結果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿各峰分離良好，對照品溶液及供試品溶液目標峰保留時間一致，且陰性對照無干擾。MRM色譜圖見圖1至圖3。

線性關系考察：分別精密量取混合對照品溶液0.010，0.025，0.050，0.100，0.250，0.500，1.000 mL，置10 mL容量瓶中，分別加初始流動相定容，按擬訂試驗條件進樣分析，以待測成分質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、定量離子峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程烏頭堿為Y1＝10 523.1X1＋12 880.9，r1＝0.997 8（n＝7），次烏頭堿為Y2＝10 970 X2＋10 392.7，r2＝0.997 4（n＝7），新烏頭堿為Y3＝12 118 X3＋2 699.81，r3＝0.999 8（n＝7）。結果表明，質量濃度線性范圍烏頭堿為0.919 8～91.980 0 ng/mL，次烏頭堿為1.048～104.800 ng/mL，新烏頭堿為1.268～126.800 ng/mL。

精密度試驗：取混合對照品溶液適量，按擬訂試驗條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為0.6%，1.1%和0.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一（批號為201703101）批樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按擬訂試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿峰面積的RSD分別為1.2%，0.9%，1.2%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批（批號為201703101）樣品，依法制備供試品溶液，共6份，按擬訂試驗條件進樣分析，并計算含量。結果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量 分 別 為1.58，25.58，11.85μg/mL，RSD分 別 為3.8%，3.9%，1.8%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號為201703101）樣品10瓶，混勻，精密量取6份樣品，各2.5 mL，再分別精密加入烏頭堿對照品溶液（質量濃度為367.9μg/mL）0.015 mL，次烏頭堿對照品溶液（質量濃度為419.2μg/mL）0.160 mL，新烏頭堿對照品溶液（質量濃度為507.3μg/mL）0.065 mL，用0.1 mol/mL的鹽酸調pH至3，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量及回收率。結果見表2。

圖1 對照品溶液MRM色譜圖A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.1 MRM chromatograms of reference solution

圖2 供試品溶液MRM色譜圖A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.2 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in test solution

圖3 陰性對照品溶液MRM色譜圖A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.3 MRM chromatograms of negative test solution

2.4 樣品含量測定

分別精密量取各批次樣品5 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂試驗條件進樣測定，以外標法定量離子峰面積，計算樣品含量。結果見表3。

3 討論

3.1 測定方法選擇

預試驗中曾嘗試用普通高效液相色譜法測定，但由于走川骨刺酊是以滲漉法提取制成，不同產地、不同采收時間和不同的炮制方法導致所用草烏藥材的烏頭類生物堿含量也不一樣，并且樣品中含有的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿量也較少，達不到高效液相色譜法的檢出要求。具有高分離能力，高選擇性、專屬性強等優點的LC-MS/MS技術，能滿足測定走川骨刺酊中3種烏頭堿含量的條件。

3.2 樣品提取方法選擇

預試驗中嘗試樣品取樣量為10 mL，氮吹干后直接用流動相定容至50 mL，濾過，進樣，但因出現平頭峰無法測定；取樣量為5 mL，氮吹干后直接用流動相定容至50 mL，再稀釋50倍后，濾過，進樣，平頭峰消失；還嘗試過40℃旋蒸蒸干、水浴鍋蒸蒸干、用0.1 mol/mL鹽酸調pH等3種方法提取，結果顯示，直接調pH提取效果較好。

表2 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n＝6）

表3 樣品含量測定結果（μg/mL）Tab.3 Results of content determination of samples（μg/mL）

3.3 固相萃取柱選擇

樣品成分較復雜，需凈化。在廠家提供的樣品中3種烏頭堿含量均較低，需對烏頭類生物堿進行痕量濃縮，而烏頭類生物堿屬有機堿類，MCX固相萃取柱是凈化和富集堿性化合物的強有力工具，特別是有機堿類，本試驗中選擇了MCX固相萃取柱對樣品進行凈化，結果達到了試驗要求。固相萃取柱在中成藥檢驗中的應用有待進一步摸索。

3.4 小結

該方法操作簡便，精密度、重復性好，專屬性高，結果準確，可用于同時測定走川骨刺酊中3種烏頭類生物堿的含量測定。不同批次樣品中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量存在一定差異，可能與使用的草烏藥材的部位、采收時間及炮制方法的不同有關。