柑橘果實風味組學研究進展

張海朋，彭昭欣，石梅艷，溫歡，張紅艷，徐娟

園藝植物生物學教育部重點實驗室/華中農業大學園藝林學學院，武漢 430070

1 風味組學概念

近些年，基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學等組學技術飛速發展，已逐漸發展成熟[1]。風味組學(flavoromics)來源于化學計量學和代謝組學領域，本質上是基于非靶向方法快速收集不同樣本的代謝數據，進而挖掘和鑒定與果實風味品質相關的代謝物[2]。風味組學源于代謝組學而又異于代謝組學，代謝組學主要是運用靶向和非靶向方法鑒定所有小分子代謝物[3]，而風味組學主要用于鑒定與風味相關的代謝組分[4]，因此，風味組學是在代謝組學的基礎上，對所有風味相關代謝物質進行針對性和綜合性分析[5]。

柑橘中的香味、苦味、酸味、甜味和質地等風味屬性相關物質主要包括影響香味的揮發性物質[6]，影響苦味的類黃酮和檸檬苦素類似物[7-8]，影響甜味的可溶性糖，影響酸味的有機酸[9]，影響果實化渣品質的木質素、果膠、纖維素和半纖維素[10]，以及影響鮮味的氨基酸和異味的醇、醛等物質。每項風味屬性都可關聯到眾多代謝物質，但并非所有代謝物質都對果實風味有貢獻，一般起決定作用的物質僅為其中幾種。雖然風味通常被描述為味覺和嗅覺的組合，但是外觀、質地、口感和消費者前期體驗記憶也在味覺中發揮重要作用，這表明多種不同的感官信號被加工以產生整體感覺，將這些感官信息整合到大腦中，最終導致味覺偏好或厭惡，并對隨后的感知和行為產生強烈影響[11]。前人對柑橘中風味物質的研究已有較多報道，但大多僅針對其中一項品質相關物質。復雜的是，不同風味屬性代謝物質在含量及感官水平上有一定的相關性，如可溶性糖產生的甜味對苦味有掩味作用[12]；在柑橘汁胞發生木質化時，其他風味也在不同程度上變淡[13]。因此，現代風味組學的相關研究不僅要有色譜、質譜等分析儀器的檢測結果，還需要結合消費者感官評價的數據，才可以綜合解析風味品質之間不同層面上的關聯性。

2 柑橘中風味組學研究進展

2.1 糖酸風味

果實甜味和酸味是消費者最關注的性狀之一，可溶性糖含量主要影響果實甜度，而有機酸主要影響酸度。柑橘中可溶性糖主要包括蔗糖、果糖和葡萄糖等，汁胞中可溶性糖隨果實發育逐漸積累，以蔗糖為主，且積累速度高于葡萄糖和果糖，不同柑橘品種中可溶性糖含量存在較大差異[14]。野生柑橘果實中糖含量與栽培種沒有顯著差異，由此可見，糖性狀在長期馴化過程中沒有發生顯著變化[15]。

柑橘果實中有機酸主要以檸檬酸為主，其含量在不同組織中有著顯著差異，主要在果實中積累。不同柑橘種質可根據有機酸含量分為低酸、中酸和高酸三類。低酸品種有紅暗柳甜橙;中酸品種有華盛頓甜橙和Valencia夏橙等；高酸品種有尤力克檸檬和馬敘葡萄柚等[16]。前人研究表明低酸品種紅暗柳甜橙汁胞中有機酸含量在不同發育期始終較低，而其野生型暗柳甜橙有機酸含量在果實發育早期顯著上升，而后逐漸降低[17]。紐荷爾臍橙在采后貯藏過程中汁胞有機酸和可溶性糖呈現下降趨勢，而2,4-D會延緩有機酸和可溶性糖降低速度[18]。研究發現野生柑橘中有機酸含量顯著高于栽培種，可能在馴化過程中受負選擇[15]。

2.2 苦 味

柑橘苦味物質主要包括兩類，一類為前苦味物質，主要為類黃酮新橘皮糖苷類化合物，以柚皮苷含量最高[8]；另一類為后苦味物質，屬于三萜類的檸檬苦素類似物，以檸檬苦素含量最高，其次為諾米林素[5,19]。

前人對同一地區生長的甜橙、寬皮柑橘、檸檬、枸櫞等果汁中類黃酮類物質進行LC-MS檢測，發現其類黃酮類物質種類和含量差異都頗大[20-21]。柑橘中類黃酮物質豐富，主要以糖苷形式存在，主要分為新橘皮糖苷和蕓香糖苷類。有前苦味的柑橘主要為柚、葡萄柚和酸橙等種質，含有大量的苦味新橘皮糖苷類物質。寬皮柑橘、甜橙和檸檬等無前苦味現象[22-23]，主要積累非苦味的蕓香糖苷類類黃酮，尤以橙皮苷含量占優[8]?？辔惰制ぼ蘸头强辔冻绕ぼ辗謩e由1,2-鼠李糖苷轉移酶(1,2RhaT)和1,6-鼠李糖苷轉移酶(1,6RhaT)催化黃烷酮-7-O-葡糖糖苷而成。前人研究表明，柚苦味種質中，1,2RhaT蛋白正常，可催化合成大量柚皮苷，而甜橙等非前苦味種質中該編碼基因發生移碼突變，不能合成苦味物質柚皮苷[8,24]。同一柑橘不同組織中前苦味物質含量也存在較大差異，如葡萄柚果肉中含有大量柚皮苷、橙皮苷和橙皮素等，但果皮中僅能檢測到少量柚皮苷和橙皮苷[20]。果實發育期也會影響類黃酮物質積累，研究發現甜橙和化州柚等類黃酮含量隨果實發育呈現下降趨勢[8,25]。而且，在貯藏過程中3種柚果實和果皮中類黃酮含量均呈下降的趨勢[26]。

柑橘種質中廣泛存在檸檬苦素和諾米林素[19]。檸檬苦素和諾米林素在溫州蜜柑果實黃皮層、白皮層和囊衣中含量較高，汁胞中含量較低；Oroblanco葡萄柚主要在囊衣中積累；檸檬苦素和諾米林素含量在上述2種柑橘中都隨果實發育逐漸降低[7,19]。開花后100～150 d紅肉處紅柚與同時期的綠肉翡翠柚相比，處紅柚黃皮層、白皮層、囊衣和汁胞中檸檬苦素和諾米林素均顯著高于翡翠柚，至果實成熟期，處紅柚汁胞中檸檬苦素和諾米林素含量分別為翡翠柚的4.91倍和4.62倍[27]。

2.3 香 味

香味物質是指被人類嗅覺感知而感受到愉悅的揮發性物質，影響柑橘的香味品質。需要說明的是，不是所有的揮發性物質都有氣味，跟其香氣活性值有關[28]；不是所有的揮發性物質都有香味，跟其結構和性質有關，也與人對香味物質的嗅聞閾值有關[29]；不是所有認為有香味的物質，都被任何人、在任何介質中或任意濃度下感知到香味。因此，揮發性物質不能被稱為香味物質。以柑橘果實為例，呈花香味的代謝物主要有β-月桂烯、順式-/反式-芳樟醇氧化物、β-芳樟醇、橙花醇和反式-橙花叔醇等，呈果香味的物質主要有乙酸甲酯、乙酸丁酯、β-月桂烯、己醇和α-石竹烯等[30]。

柑橘果實中富含揮發性萜類物質，還產生芳香族化合物、醛、酮和酯類物質等其他揮發性成分，其中萜類物質均在含量和種類上占優[28]。大多數柑橘種質果實中最主要的揮發性物質均為d-檸檬烯[6,31]。特征香氣物質則因種質而異，如β-月桂烯、順式-/反式-芳樟醇氧化物對莽山野柑的花香和膏香味有貢獻[28]；瓦倫烯、芳樟醇和丁酸甲酯則分別為甜橙[32]、宮本溫州蜜柑[33]和血橙的特征香氣物質[34]。Zhang等[35]研究表明莽山野柑特征香氣可通過花粉直感效應傳遞到授粉果實上，顯著提高華農紅柚汁胞中順式-、反式-芳樟醇氧化物含量。基于66個柑橘種質果皮揮發性物質的主成分分析(PCA)，可以將寬皮柑橘、甜橙、柚和檸檬明顯區分開。不同柑橘種類間，如寬皮柑橘、甜橙、檸檬和柚等香味品質各不相同，利用偏最小二乘法分析發現有33種潛在影響香味品質差異的揮發性物質[36]，但這些物質對不同柑橘種類特殊香味品質的貢獻度還需要進一步研究。此外，果實發育期、外源激素和是否感病等都會顯著影響柑橘果實萜烯類物質組成和含量變化，從而導致香味品質的變化[37-39]。目前，柑橘中揮發性物質的研究主要集中在代謝物質檢測和鑒定方面，特征香味物質鑒定還有待進一步深入開展。

2.4 質地品質

在咀嚼柑橘可食用部位的同時，消費者會感受到化渣性、韌性、脆性及細胞破碎時散發出的糖酸味及氣味。因此，果實的質地品質與消費者口感和咀嚼性密切相關，本文也將其歸入風味品質，主要由木質素、果膠、纖維素和半纖維素等物質含量來決定。如圖1所示，由于不同柑橘種質食用部位有所不同，主要質地風味品質可分為4種類型：第一類為食用囊衣和汁胞的寬皮柑橘(含雜柑)和甜橙，需要關注汁胞和囊衣的化渣性；第二類為僅食用汁胞的柚和葡萄柚，主要關注汁胞的脆性及囊衣的韌性，以評估是否容易揭去囊衣且無大片殘余；第三類為食用白皮層部位的佛手和枸櫞等，除糖酸含量外，要關注白皮層含水量、化渣性、脆性和細胞緊密度等；最后一類為食用整果的金柑，黃皮層、白皮層、囊衣和汁胞的化渣性及脆性都對質地風味有貢獻。

因種質不同，柑橘果實的質地品質存在較大差異。如愛媛28號果肉化渣性強，砂糖橘化渣較好，而貯藏一定時期后的紅肉臍橙發生枯水而影響化渣性等。熟期對質地品質有一定影響，成熟期質地品質一般較好，采后貯藏措施不當時果實汁胞枯水，木質素含量升高，進而影響果實的化渣性[40]。研究發現外源激素IAA和ABA可影響華農紅柚汁胞木質素合成，為外源激素調控柑橘汁胞木質化提供有效思路[10]。

A：寬皮柑橘; B:甜橙; C:金柑; D:枸櫞; E:柚; FL：黃皮層； AL：白皮層； MS：囊衣； JS：汁胞； SE：種子；CC：中柱。A:Loose-skin mandarin; B:Sweet orange; C:Fortunella japonica; D:Citron; E:Pummelo. FL:Flavedo; AL:Albedo; MS:Membrane segment; JS:Juice sacs; SE:Seed; CC:Central column.

2.5 異 味

異味物質的有否與含量高低是消費者購買商品的另一個主要影響因素。柑橘果實發育過程中醇和醛類物質數量少且含量變化不大[37]。柑橘中異味物質主要產生于貯藏過程中，目前研究主要集中于小分子醇和醛類物質。當果實供氧不足，致使無氧呼吸產生的代謝產物乙醇和乙醛等物質積累而產生異味[41]。研究表明氨基酸和脂肪酸代謝產物，如三甲基丁醇、2-甲基丁酸乙酯等物質含量在貯藏過程中顯著增加，導致異味產生。柑橘貯藏期低溫措施會影響柑橘乙醇和乙醛物質的積累，促進Valencia夏橙和Olinda夏橙果實異味產生[42-43]。果實打蠟是提高果實光潔度的重要技術措施，但同時引起果實無氧呼吸、導致乙醇增加，而選用透氣性較好的蠟液配方材料會減少異味物質積累[44]。

3 風味組學研究策略與方法

3.1 儀器分析策略

風味相關物質主要為分子質量較低的初生和次生代謝物。所使用的檢測儀器主要為：氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)，用于檢測揮發性物質和初生代謝物質[6,15]；氣相色譜-嗅聞聯用儀(GC-O)主要用于香氣活性物質鑒定[35]；高效液相色譜(HPLC)，主要用于類黃酮、類胡蘿卜素、纖維素、果膠的測定[7,10,27]，也可以分析可溶性糖和有機酸等；液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)主要用于靶向和非靶向代謝物檢測[20]。

在利用色譜分析時，風味相關代謝物質的定性分析方法主要依據紫外可見吸收光譜特性和標準品的保留時間，但2種以上代謝物質共分離情況時有發生，且不同色譜柱型號會導致保留時間改變，所以色譜定性時要結合標準品鑒定。風味相關代謝物質的定量方法有結合內標的相對定量和利用標準品的標準曲線絕對定量(外標法)[6]。相對定量是基于內標含量定量，性質越相似，定量相對越準確；利用標準品的標準曲線絕對定量更加準確[45]。

在利用質譜分析時，GC-MS因具有標準統一的質譜條件，可基于標準品鑒定，也可基于NIST(2015)和Wiley Registry等質譜數據庫鑒定。LCMS沒有標準化的質譜條件，主要靠標準品及化合物的精確分子質量定性，也可根據二級質譜信息并解析斷鍵方式來對物質初步定性。需要注意的是，在對代謝物質進行定性分析時，絕大多數是在沒有標準品的情況下進行，可通過查找數據庫和前人文獻，結合相似物種的代謝物定性結果來提高定性的準確性。

3.2 風味評價及風味物質的貢獻度

不同的風味代謝物質都有感官閾值，即能讓人體感知到的最低濃度值。該感官閾值會隨著介質的變化而變化[2]。所以，某一代謝物質對風味品質的貢獻度主要由其感官閾值、含量及所共存的介質等共同決定[46]。

如圖2所總結，前人文獻[28,30,35]中對風味相關物質的鑒定流程，首先對代謝物進行提取、檢測和鑒定，進而分析含量差異代謝物；或經主成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS-DA)分析鑒定重要候選代謝物；然后對候選代謝物進行分離純化，基于電子鼻、電子舌或利用感官評價人員對候選代謝物進行評價；最后評估候選代謝物對果實風味品質的貢獻[28,30,35]。

SE：液相萃?。籗PME：固相微萃??； HS-SPME：頂空-固相微萃??； GC-MS：氣相色譜質譜聯用儀； HPLC：液相色譜儀； LC-MS：液相色譜質譜分析儀； PCA：主成分分析； PLS-DA：偏最小二乘法分析； GC-O：氣相色譜-嗅聞聯用儀； UPLC：超高效液相色譜儀。SE:Solvent extraction; SPME:Solid-phase micro extraction; HS-SPME:Headspace solid-phase micro extraction;GC-MS:Gas chromatography-mass spectrometry; HPLC:High performance liquid chromatography;LC-MS:Liquid chromatography- mass spectrometry; PCA:Principal component analysis;PLS-DA:Partial least squares-discriminant analysis; GC-O:Gas chromatography-olfactometry; UPLC:Ultrahigh-performance liquid chromatography.

3.3 風味評價與代謝組學關聯鑒定風味物質

風味評價與代謝組數據關聯分析的方法研究較少，目前主要為相關性分析、偏相關分析、PLS-DA及PCA等。前人在對陳皮和廣陳皮揮發性物質進行檢測后，利用PLS-DA分析發現15種標志代謝物可區分陳皮與廣陳皮[47]。但是，基于數據分析僅能得到潛在作用的候選物質，后續研究仍需要結合風味重構和感官評價等試驗進一步確認。Liu等[28]首先利用莽山野柑與4種其他類型柑橘果實為材料檢測其揮發性物質譜，分析在含量上有顯著差異的代謝物，確定候選代謝物；然后利用GC-O對候選代謝物的香氣特性進一步篩選，結合香氣稀釋試驗(AEDA)分析候選代謝物的閾值；最后對候選代謝物進行香氣重構，確定莽山野柑的特征香氣物質為順式-、反式-芳樟醇氧化物和β-月桂烯，而芳樟醇和d-檸檬烯提供其背景香氣。

如圖3所示，結合前人的相關文獻[30,36]，我們總結出柑橘中特定風味相關物質的鑒定流程。

圖3 多平臺綜合分析確定柑橘中特定風味相關物質的技術流程

4 風味組學的應用展望

柑橘代謝組學方面已取得較大進展，但風味組學研究開展較少。代謝組學檢測到的物質數量巨大，很難通過數據分析明確代謝物對柑橘風味的作用。風味組學的相關研究需要與消費者的喜好進行對接，明確消費者偏好的風味品質所關聯的代謝物質，為不同人群提供符合其口味偏好且營養健康的產品，才是柑橘乃至整個園藝產業期望達到的目的。而這些對人體有益的風味相關代謝物質及其合成與調控機制的研究成果，可以直接應用于合成生物學領域或栽培技術的更新及定向育種中，指導園藝產業的升級和健康發展。

我國柑橘產量居世界第一，成熟季節會有大量果實滯銷而造成果農經濟損失。與世界上其他柑橘主產國不同，榨汁、果汁和罐頭等專用品種的育種和栽培研究投入欠缺，反而是解決水果滯銷的有效出路之一。但是，如何改善果汁等制品的品質，同樣需要進行風味組學與感官評價分析。眾所周知，甜味(糖)增加了柑橘果實的適口性，但出于健康考慮，消費者可能越來越希望減少糖含量而不影響果實甜味。可以結合風味組學和感官評價對味覺系統不斷了解及探索植物天然甜味代謝物，通過直接瞄準口中的味覺傳感器，在不增加糖含量的情況下提高甜度的新策略，旨在改善消費者味覺體驗。除此之外，對香味、苦味等的分析也有助于提升柑橘果品品質。最終目的是增加柑橘果實中對人體有益物質的含量，而不影響柑橘果實的口感。

柑橘果實中有數以萬計的代謝組分，利用風味組學方法可分析得到哪些代謝物對風味品質有貢獻且其貢獻度如何，并將主要貢獻者定義為該品質性狀的標志性代謝物。整合所有風味品質標志性代謝物后，可將其進一步開發為代謝組指紋圖譜，用于預測新種質或新產品的消費者接受度，提升柑橘育種效率，還可應用于新品種保護或鑒偽等。

致謝：感謝朱晨橋博士和馮迪博士研究生提供的金柑和枸櫞照片。