1株克氏原螯蝦肺炎克雷伯菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

董靖，張露珊，劉紹春，張國棟，周順，楊秋紅，艾曉輝

1.中國水產科學研究院長江水產研究所/湖北省水產品質量安全工程技術研究中心，武漢 430223；2.岳陽漁美康生物科技有限公司，岳陽 414100

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，原產于墨西哥東北部和中美洲南部地區，1929年經日本引進到中國，因其可以為人類提供豐富的優質蛋白、維生素B和礦物質等營養成分而成為風靡多個國家和地區的食品[1-2]。近年來隨著國內小龍蝦養殖規模的逐漸擴大，養殖的集約化程度也有所提升，但由于基礎薄弱、優質種苗供應不足、病害多發和藥物濫用等問題嚴重阻礙小龍蝦產業的健康發展。尤其小龍蝦養殖進入5月份后往往會大面積暴發疾病，造成小龍蝦大量死亡，通常稱為“五月瘟”[3]。其中，由強致病性的細菌、真菌、病毒和寄生蟲等病原體導致的小龍蝦各種感染性疾病尤為嚴重[4]。化學類抗菌藥物是日常生產中用于防治小龍蝦病害的主要手段，但極易導致環境中抗菌藥物的污染和細菌耐藥性的產生。此外，大量化學抗菌藥物的使用容易造成藥物在小龍蝦體內的蓄積和殘留，影響小龍蝦產品的質量安全[5-6]。

肺炎克雷伯菌隸屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，是一種常見的條件性致病菌，也是一種重要的人獸魚共患病原菌，能導致魚類、陸生動物和人的多種感染性疾病[7]。自1992年首次在海、淡水魚水產品中檢測到肺炎克雷伯菌后，肺炎克雷伯菌被發現能導致多種水產養殖動物的感染，如大鯢(Andriasdavidianus)、團頭魴(Megalobramaamblycephala)、中華鱉(Trionyxsinensis)等[8-10]。疫苗和化學抗菌藥物是治療肺炎克雷伯菌感染的主要手段，但目前尚無用于水產養殖源肺炎克雷伯菌感染的疫苗面世。因此，對水產養殖源肺炎克雷伯菌感染的治療主要依賴化學抗菌藥物[7,11]。而抗菌藥物的廣泛應用和濫用也不可避免地導致了肺炎克雷伯菌耐藥菌株的產生。

2019年5月湖北省潛江市一小龍蝦養殖場發生了小龍蝦“五月瘟”，導致了大量的小龍蝦死亡。筆者通過對患病小龍蝦的病原學檢查發現其存在肺炎克雷伯菌感染的情況，進一步通過回歸感染試驗確定了該分離菌株對小龍蝦的致病力。此外，通過藥敏試驗和最小抑菌濃度測定等方法研究了該分離菌株的敏感性，旨在為小龍蝦“五月瘟”病原分析和疾病防控提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病小龍蝦樣品采集自湖北省潛江市某小龍蝦養殖場；用于回歸感染試驗的健康小龍蝦來自長江水產研究所荊州基地；抗生素標準品頭孢拉定、氨曲南、氨芐西林、亞胺培南、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、多粘菌素E、美羅培南、環丙沙星、阿莫西林、頭孢他啶、氟苯尼考、四環素、苯唑西林、恩諾沙星、多西環素購自北京索萊寶科技有限公司；頭孢唑肟、慶大霉素、阿奇霉素購自上海源葉生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒、PCR Master Mix等分子生物學試劑購自TaKaRa公司；腦心浸液(BHI)培養基購自青島海博生物有限公司。

1.2 細菌分離和純化

取瀕死小龍蝦在無菌條件下用生理鹽水反復沖洗體表3～5次，在超凈工作臺中剖取小龍蝦的肝胰腺，用生理鹽水沖洗后采用勻漿器將其研磨均勻。取研磨液在腦心浸液(BHI)固體培養基上劃線，將平板置于30 ℃培養16～20 h。從平板中挑取單菌落反復劃線純化2～3次，將得到的純化菌株置于4 ℃保存，標記為L20190516。

1.3 回歸感染試驗

從純化好的平板無菌挑取L20190516菌株的單菌落接種至BHI液體培養基中，30 ℃振蕩培養至對數生長中期。培養好的菌液用麥氏比濁管稀釋成1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104cfu/mL的菌懸液。選取活力較好、無明顯外傷的小龍蝦作為試驗動物，每組30尾，通過腹腔注射的方式在第2腹節和第3腹節之間注射菌液0.1 mL，陰性對照組注射0.1 mL無菌生理鹽水。將注射后的蝦暫養于玻璃缸內，保持水溫23～25 ℃，溶氧在5.5～7.5 mg/L，期間正常換水但不投喂飼料。感染后每天觀察并記錄不同組別小龍蝦的活動情況和死亡數，連續觀察10 d。通過Bliss法計算其半數致死濃度 (LC50)[12]。取感染后瀕死的小龍蝦肝胰腺進行病原的分離和鑒定。

1.4 細菌生理生化鑒定

從純化的平板上挑取L20190516菌株的單菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態特征。此外，將受試菌株的單菌落用無菌生理鹽水重懸后加入到API20E生化鑒定試劑條上，按產品說明書操作，在28 ℃條件下培養24 h后將鑒定試劑條置于ATB 32GN細菌鑒定系統中進行生化鑒定。

1.5 細菌分子鑒定

參照細菌基因組提取試劑盒操作說明書提取菌株L20190516的全基因，以提取的全基因組作為模板，采用16S rRNA通用引物進行擴增[13]。用于鑒定的通用引物核苷酸序列：上游引物(16S rRNA-F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′，下游引物(16S rRNA-R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′， PCR產物的長度約為1 500 bp。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠檢測并測序。采用Blast軟件對測序結果進行同源性比對。從Blast結果中選取與菌株L20190516同源性較高的相關已知序列，采用MEGA5.1軟件進行多重序列比對分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹，校正模型為Kimura 2-parameter，通過Bootstraps法自舉數集1 000次。

1.6 藥物敏感性測試

L20190516菌株對常用抗菌藥物的敏感性通過紙片擴散法(K-B)進行測定[14-15]。在超凈工作臺中無菌挑取L20190516單菌落至BHI液體培養基中，在30 ℃搖床中振蕩培養至對數生長中期。培養好的菌液通過離心收集菌體并用無菌PBS重懸，通過麥氏比濁管將菌液濃度調整至1.5×108cfu/mL。將菌液充分混勻后涂布至MH瓊脂培養基上，在30 ℃生化培養箱中繼續培養18～24 h后用游標卡尺測定不同抗菌藥物的抑菌圈直徑。敏感性結果判定參照杭州微生物試劑有限公司提供的判定標準。

1.7 最小抑菌濃度測定

采用CLSI推薦的肉湯微量稀釋法測定不同抗菌藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations,MICs)。在96孔板中將配好的抗菌藥物進行倍比稀釋，每孔內藥物體積為100 μL，然后加入100 μL稀釋好的菌懸液，使每孔中菌懸液的濃度為5×105cfu/mL。每種藥物設置3次重復，不加藥不加菌的孔設置為陰性對照，不加藥加菌的孔設置為陽性對照。將加好的培養板放置于生化培養箱中，30 ℃條件下培養18～24 h。MICs定義為沒有細菌生長的最小濃度。

2 結果與分析

2.1 分離株的培養特性

發病小龍蝦活力降低，應激能力差，采食量下降，進地籠后死亡的現象較多，其中大蝦死亡情況較為嚴重。剖檢發現其肝胰腺發白，腸道內容物較少，肝胰腺積水。采取患病蝦的肝胰腺進行細菌分離，得到的優勢菌在平板上形成半透明、顏色灰白、中央隆起的光滑菌落。經革蘭氏染色鏡檢發現該菌為短桿狀革蘭氏陰性菌。

2.2 分離株對小龍蝦的毒力

健康小龍蝦注射不同劑量的L20190516菌懸液后出現了一定程度的發病和死亡，高濃度攻毒組出現了急性死亡現象，在3 d內全部死亡，而陰性對照組在試驗期間沒有明顯的發病和死亡(表1)。感染后的小龍蝦表現為活動減緩、無力等癥狀，剖檢發現其肝胰腺發白，有部分出現積水現象。采用Bliss法得到了該菌株對小龍蝦的LC50為2.13×105cfu/mL。對出現典型癥狀及瀕死小龍蝦進行剖檢、細菌分離得到了與L20190516菌株性狀一致的菌落。

表1 分離株感染健康小龍蝦后的死亡率 Table 1 Mortality of the isolate on healthy crayfish

2.3 生化鑒定結果

對分離純化的優勢菌接種于API20E生化鑒定條，經過孵育后置于ATB細菌自動鑒定系統中鑒定。結果發現該優勢菌的生化特征符合肺炎克雷伯菌的特征，相似度大于98%。生化鑒定結果見表2。

表2 分離株的生化鑒定結果 Table 2 Biochemical characterization of the isolate

2.4 16S rRNA序列分析

通過PCR擴增得到了分離株L20190516的16S rRNA片段，長度約為1 500 bp，PCR產物經純化后直接測序。將得到的序列(MT409892)與GenBank數據庫中的已知基因序列同源性比對，構建系統發育樹。結果發現，分離株L20190516與肺炎克雷伯菌(KX237750.1、KU937377.1)、大腸桿菌(LR025099.1)、產氣克雷伯菌(LR134254.1)聚為一支(圖1)，同源性為99%。結合該菌株的生理生化特征和系統發育樹情況將該菌株判定為肺炎克雷伯菌。

2.5 藥敏試驗結果

通過K-B法測定20種化學抗菌藥物的敏感性，其結果見表3。該菌株對頭孢噻肟、多粘菌素B敏感，對新霉素、亞胺培南中度敏感，對恩諾沙星、多西環素、氟苯尼考等16種藥物耐藥。通過肉湯微量稀釋法測定20種藥物的最小抑菌濃度，結果如表4所示。

圖1 L20190516菌株的系統發育樹

表3 L20190516分離株對20種抗菌藥物敏感性 Table 3 Antibiotic susceptibility of L20190516strain to 20 kinds of antibiotics

表4 抗菌藥物對L20190516分離株的MICs Table 4 The MICs of antibiotics to L20190516

3 討 論

近年來，隨著水產養殖業的迅猛發展，有關水產養殖來源的致病菌的報道越來越多，病害頻發對水產養殖業的發展造成了一定的影響。隨著小龍蝦消費市場的打開，人們養殖小龍蝦的熱情高漲，養殖規模不斷擴大，隨著養殖規模和面積的不斷增加，小龍蝦病害也越來越多，給小龍蝦養殖造成了慘重的損失[16]。小龍蝦的細菌性病害主要由檸檬酸桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬等引起[16-19]。本試驗首次從湖北潛江發病小龍蝦中分離到1株優勢菌，經過回歸感染試驗發現該菌株對健康小龍蝦致病，在感染小龍蝦體內再次分離到該菌株，而陰性對照組未分離到；進一步通過生理生化鑒定、16S rRNA鑒定和系統發育樹構建將該菌株鑒定為肺炎克雷伯菌。此外，本試驗通過ELISA法(酶免生物)和鏡檢法分別排除了患病小龍蝦感染白斑綜合征病毒和寄生蟲的可能。回歸感染試驗前將小龍蝦暫養10 d后再選取健康個體入組，試驗時設置了注射無菌生理鹽水的陰性對照組且在試驗過程中陰性對照組未發生死亡，表明各試驗組小龍蝦的死亡均由感染肺炎克雷伯菌引起，而非未檢測到的未知病原體。

譚愛萍等[11]、盧玉婷等[20]、滕濤等[9]分別從鰻鱺、鯉、團頭魴體內分離到肺炎克雷伯菌，發現該菌主要引起養殖魚類的腹水、內臟器官充血腫脹等癥狀，認為肝臟(肝胰腺)可能是肺炎克雷伯菌主要侵害的靶器官。本試驗發現肺炎克雷伯菌能導致小龍蝦肝胰腺發白、采食量下降和腸道內容物減少等主要癥狀，該菌感染主要發生于5月中旬水溫在25 ℃左右時。綜合以上信息可以推斷肺炎克雷伯菌是小龍蝦“五月瘟”的病原體之一。

自2001年首次發現了對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌后，產KPC酶及耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌不斷被發現，導致臨床中對肺炎克雷伯菌的治療越來越難[21]。滕濤等[9]研究了團頭魴源肺炎克雷伯菌對27種抗菌藥物的敏感性，發現僅對磷霉素、復方新諾明和氨曲南3種藥物敏感。譚愛萍等[11]發現鰻源肺炎克雷伯菌僅對亞胺培南、鏈霉素和阿米卡星3種藥物敏感，對其余17種受試藥物均耐藥。童桂香等[22]分析了山瑞鱉(Paleasteindachneri)肺炎克雷伯菌的耐藥性，發現該菌對受試的30種藥物中的頭孢西叮、舒普深(頭孢哌酮、舒巴坦)和阿米卡星敏感，對特治星(哌拉西林、他唑巴坦)中度敏感，對其余26種藥物耐藥。從以上研究可以推斷出水產源肺炎克雷伯菌耐藥性較為嚴重，且大部分分離菌株具有多重耐藥性。本試驗所分離的肺炎克雷伯菌僅對受試的20種抗菌藥物中的頭孢噻肟和多粘菌素B敏感，該結果提示本次分離的菌株為多重耐藥肺炎克雷伯菌。