不同溫度下恩諾沙星在克氏原螯蝦體內的藥代動力學

王歡，許荔立，陳孝煊,3，袁軍法，田丁，蔣飛，吳志新,3

1.華中農業大學水產學院，武漢 430070； 2.湖北省水生動物病害防控工程技術研究中心，武漢430070；3.水產養殖國家級實驗教學示范中心(華中農業大學)，武漢 430070

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)具有分布廣泛、適應力強、繁殖力高等特點，在我國部分濕地形成自然種群[1]，是我國重要的淡水養殖品種之一。2018年克氏原螯蝦經濟總產值已達3 690億元，養殖密度的提高以及養殖水體污染等原因，導致克氏原螯蝦疾病頻發。副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、擬態弧菌(Vibriomimicus)等細菌性病原被認為是造成螯蝦某養殖業經濟損失的原因之一[2-4]。

恩諾沙星enrofloxacin(ENR)作為人工合成的廣譜抗菌藥，具有對細菌選擇性高，口服給藥迅速，生物利用度高，半衰期較長，血藥濃度、毒副作用小等特點應用于獸醫臨床，預防和治療多種細菌和支原體感染，在臨床治療中已成為很多感染性疾病的首選藥物，使用頻率僅次于青霉素類[5]。

國內外學者采用不同的給藥方式，研究了恩諾沙星在水生動物中的藥物動力學及殘留特征，如銀鯽(Carassiusauratusgibelio)(肌肉注射)[6]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)(靜脈注射和口灌)[7]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)(肌肉注射和口灌)[8]、大西洋馬蹄蟹(Limuluspolyphemus)(圍心竇注射)[9]等。本研究分析了在18 ℃和25 ℃ 2種溫度下克氏原螯蝦圍心竇注射20 μg/kg的恩諾沙星后，恩諾沙星及其代謝物環丙沙星(ciprofloxacin,CIP)在蝦體內的組織分布和藥代動力學特征，以期為制定合理用藥量和休藥期提供指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Agilent 1200型高效液相色譜儀，Agilent Chemistation色譜工作站，美國Agilent公司；全自動樣品快速研磨儀，上海凈信實業發展有限公司；MTN-2800W恒溫水浴氮吹裝置，天津奧賽恩斯儀器有限公司；WH-2微型漩渦混合儀，上海滬西儀器分析廠。

1.2 藥品與試劑

恩諾沙星標準品(純度99%)、環丙沙星標準品(純度98%)，Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；色譜級乙腈和甲醇，美國Tedia公司；正己烷、乙腈、三乙胺等試劑為分析純，購于國藥化學試劑有限公司。恩諾沙星原粉(含量99%)，上虞京新藥業有限公司。

恩諾沙星與環丙沙星標準儲備液的配制：分別準確稱取0.01 g恩諾沙星及環丙沙星標準品，分別用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液助溶，用超純水定容至100 mL，配置成100 μg/mL的標準儲備液。

恩諾沙星注射液的配制：稱取4 g的恩諾沙星原藥，用少量氫氧化鈉溶液助溶，用超純水定容至100 mL，配置成40 mg/mL的標準儲備液。

1.3 試驗動物

試驗所用克氏原螯蝦來自湖北武漢克氏原螯蝦某養殖基地，平均體質量(20.0±2.0) g，暫養于消毒后的水族箱中，試驗用水為經過曝氣的自來水,分別控制水溫在(18±1) ℃和(25±1) ℃。試驗前停食1 d，選擇健康活潑的蝦進行試驗。

1.4 試驗方法

1)色譜條件。色譜柱：Shodex Silica C18(250 mm ×4.6 μm，5 μm)，流動相：0.05 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調節pH值至2.4)/乙腈=86/14(V/V)；流速：1.0 mL/min；紫外線檢測波長：278 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

2)給藥與取樣。正式給藥前禁食1 d，給藥前采集空白血淋巴及組織樣品檢測是否有藥物殘留。用100 μL微量注射器將恩諾沙星藥液注射到克氏原螯蝦圍心竇，劑量為20 μg/kg(約10 μL)。于 0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、120 h時間點采集血淋巴、肌肉、肝胰腺。每個時間點取6只螯蝦。使用注射器從圍心竇取血淋巴，并取肌肉、肝胰腺，樣品保存于-80 ℃冰箱。

3)樣品處理。冷凍保存的樣品室溫下自然解凍。吸取0.5 mL血淋巴于10 mL離心管中，加入7 mL的提取液(1 mol/L鹽酸∶乙腈=4∶500，V/V)，旋渦混合2 min，8 000 r/min 離心10 min，將上清液置于40 ℃恒溫水浴氮氣吹干。準確加入1 mL流動相，過0.22 μm濾膜，濾液用高效液相色譜儀檢測。取1 g組織(肌肉、肝胰腺)勻漿，加入1 mL氯化鈉溶液(1 mol/L)和1 mL PBS緩沖液，渦旋振蕩2 min，加入4 mL酸化乙腈(1 mol/L鹽酸∶乙腈=4∶500，V/V)，渦旋混合2 min，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min。提取上清液移入另一離心管中，殘留物加4 mL酸化乙腈充分渦旋震蕩2 min，4 ℃下8 000 r/min離心10 min，提取上清液。合并上清液，取上清液于氮吹儀上40 ℃氮吹至干，用1 mL流動相溶解，2 mL正己烷去脂，取下清液用0.22 μm濾膜過濾，濾液用高效液相色譜檢測藥物含量。因為肝胰腺中脂肪含量較多，增加一次去脂步驟。

4)標準曲線。將標準工作液用超純水分別稀釋為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL標準稀釋液，取10 μL進樣檢測進行分析。以藥物峰面積為縱坐標(Y)，標準質量濃度C(μg/mL或μg/g)為橫坐標(X)做標準曲線，計算回歸方程及相關系數。

5)工作曲線。將克氏原螯蝦中空白血淋巴或空白組織勻漿，加入已知濃度的標準溶液，制成含恩諾沙星和環丙沙星為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL(μg/g)的血淋巴樣品和組織樣品。將各樣品將按照本文“1.4”樣品方法處理后，進行HPLC分析，求出工作曲線方程和相關系數。

6)回收率、精密度和檢測限。取空白血淋巴和組織，分別添加100、10、1 μg/mL標準溶液100 μL，使各組織恩諾沙星、環丙沙星藥物含量為10、1、0.1 μg，將各樣品處理后，每個質量濃度重復測定3次，連續測定3 d，計算回收率和精密度。以引起3倍信噪比(S/N=3)的濃度為檢測限。

2 結果與分析

2.1 色譜行為

恩諾沙星和環丙沙星出峰時間分別為9.529、13.351 min，目標藥物峰形明顯尖銳，基線平穩(圖1)。本方法可以有效地分離恩諾沙星和環丙沙星，在樣品中與其他色譜峰明顯分離，無干擾峰(圖2～4)。

圖1 恩諾沙星(ENR)和環丙沙星(CIP)標準溶液色譜圖

圖2 空白血淋巴色譜圖與加標血淋巴色譜圖

圖3 空白肌肉色譜圖與加標肌肉色譜圖

圖4 空白肝胰臟色譜圖與加標肝胰腺色譜圖

2.2 分析方法驗證

恩諾沙星和環丙沙星的標準曲線方程分別為Y=61.618X-2.6977，Y=60.376X+0.1429，相關系數R2均大于0.99。恩諾沙星及環丙沙星在0.01～20 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好(表1)。各組織中恩諾沙星和環丙沙星回收率均在80%～110%，說明回收率是在合理范圍的(表2)。檢測值日內變異系數均小于5%，日間變異系數均小于6%；檢測限在0.003～0.008 μg/mL(μg/g)，均低于歐盟(0.1 μg/mL 或μg/g)和日本(0.01 μg/mL或μg/g)規定的最高殘留限量，表明本試驗所用樣品前處理和高效液相色譜檢測方法具有較高的精確度。

表1 恩諾沙星和環丙沙星的工作曲線方程和相關系數 Table 1 ENR and CIP work composition line sum correlation number

表2 恩諾沙星和環丙沙星的回收率、變異系數、檢測限 Table 2 ENR and CIP-like recovery rate,variation number,limit of measurement

2.3 恩諾沙星和環丙沙星在克氏原螯蝦體內的藥-時變化規律

注射給藥后，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴的藥時曲線見圖5。由圖5可見，恩諾沙星在18 ℃和25 ℃下在0.083 0 h達到峰值，分別為20.185 4 μg/mL和19.248 6 μg/mL，1～8 h恩諾沙星藥物質量濃度呈快速下降趨勢，8～120 h時藥物質量濃度緩慢下降。18 ℃時環丙沙星在2 h達到第1個峰值(18 ℃為0.054 0 μg/mL)，24 h時會出現第2個峰值(0.050 0 μg/mL)；25 ℃時環丙沙星在2 h有1個峰值(0.072 6 μg/mL)。

注射給藥后，恩諾沙星在克氏原螯蝦肌肉中的藥時曲線見圖6。恩諾沙星在25 ℃(0.026 3 h)比18 ℃(0.344 7 h)更快達到峰值，隨后出現緩慢下降，18 ℃時在6 h會出現第2個峰(9.848 5 μg/g)。18 ℃時，環丙沙星在0.75 h達到峰值(0.150 3 μg/g)，在8 h時出現第2個峰(0.157 9 μg/g)。25 ℃時，環丙沙星在0.25 h達到峰值(0.733 9 μg/g)，在4 h達到第2個峰，然后很快下降。

圖5 18 ℃(A)和25 ℃(B)下單次注射后ENR和CIP在血淋巴中的藥-時曲線(n=6)

圖6 18 ℃(A)和25 ℃(B)下單次注射后ENR和CIP在肌肉中的藥-時曲線(n=6)

單次注射給藥后，恩諾沙星在克氏原螯蝦肝胰腺中的藥時曲線見圖7。18 ℃時，恩諾沙星質量濃度在0～1 h時間段快速上升，4 h達到峰值，4～8 h出現快速下降；25 ℃時，恩諾沙星質量濃度在1 h達到峰值。18 ℃下環丙沙星分別在0.75、4 h達到峰值；25 ℃時，環丙沙星濃度在2 h達到峰值。

圖7 18 ℃(A)和25 ℃(B)下單次注射后ENR和CIP在肝胰腺中的藥-時曲線(n=6)

2.4 藥代動力學特征

恩諾沙星在克氏原螯蝦體內的藥時數據用PK2.0軟件和Graphpad Prism5軟件進行擬合分析，結果顯示，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴中的藥時數據符合二室開放模型，恩諾沙星在克氏原螯蝦肌肉和肝胰腺中的藥時數據符合一級吸收二室開放模型，其動力學參數見表3。環丙沙星在克氏原螯蝦體內的藥時數據為非房室模型，其主要動力學參數見表4。

表3 恩諾沙星在克氏原螯蝦體內的藥代動力學參數 Table 3 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in Procambarus clarkii

表4 環丙沙星在克氏原螯蝦體內的藥代動力學參數 Table 4 Pharmacokinetic parameters of ciprofloxacin in Procambarus clarkii

3 討 論

3.1 恩諾沙星在克氏原螯蝦體內的藥代動力學特征

恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴中的藥時數據符合二室開放模型，在肌肉和肝胰腺中的藥時數據符合一級吸收二室開放模型，這與恩諾沙星在三疣梭子蟹[10]、金鱒[11]、西伯利亞鱘[12]、中華絨螯蟹[13]中的結果相似。

本試驗中，在18 ℃水溫下，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的Tmax分別為0.083 0、0.344 7、1.933 5 h，Cmax分別為20.185 4、13.221 3、16.555 5 μg/mL，在25 ℃水溫下，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的Tmax分別為0.083 0、0.263 4、1.165 8 h，Cmax分別為19.248 6、16.425 0、30.731 3 μg/mL，這說明溫度較高時，恩諾沙星在克氏原螯蝦體內達峰時間快。與不同溫度下恩諾沙星在中華絨螯蟹中的達峰時間快和達峰濃度的規律一致[13]。

18 ℃水溫下，恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的T1/2α分別為0.896 5、3.559 6、6.641 1 h，AUC(0-t)分別為514.306 2、494.711 3、745.454 9(μg·h)/mL；25 ℃時T1/2α分別為0.297 3、1.681 1、11.174 5 h，AUC(0-t)分別為257.857 3、531.497 0、1 293.194 5(μg·h)/mL。AUC越大，說明恩諾沙星在克氏原螯蝦中分布越廣泛，可以更好地起到殺菌作用。溫度較高時，恩諾沙星在血淋巴、肌肉中的分布半衰期更短。在大菱鲆中，溫度同樣促進了分布半衰期的減少[7]。

消除半衰期T1/2β和清除率CL是藥物在體內消除快慢的主要藥動學參數[13]。18 ℃時恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的T1/2β分別為68.552 7、58.914 4、74.622 1 h，25 ℃時分別為18.608 7、52.743 7、55.740 3 h。18 ℃恩諾沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的CL分別為0.021 9、0.027 2、0.011 2 L/(h·kg)，25 ℃時分別為0.065 5、0.028 0、0.012 6 L/(h·kg)，溫度提高，血淋巴、肌肉、肝胰腺中的恩諾沙星消除加快，這與有關的研究結果一致[14]。溫度提高可以促進恩諾沙星在克氏原螯蝦體內的分布和消除，但由于生物種類、給藥劑量、養殖環境的不同，恩諾沙星代謝程度存在差異[15-17]，與其他甲殼類動物[18]一樣，克氏原螯蝦擁有開放性循環系統，肝胰腺是藥物吸收的主要器官，因此肝胰腺中藥物濃度高、消除半衰期較長。

3.2 環丙沙星在克氏原螯蝦體內的藥代動力學特征

研究表明，恩諾沙星在水生動物體內大部分以原藥形式存在，有一部分去乙基代謝轉化為環丙沙星[19]，因此研究恩諾沙星的代謝產物環丙沙星在體內的藥代動力學同樣具有重要意義。在本試驗中，18 ℃時環丙沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的消除斜率常數分別為0.005 0、0.003 1、0.011 5 1/h，在肝胰腺中消除最快，其次是血淋巴、肌肉。25 ℃水溫條件下環丙沙星在克氏原螯蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的消除斜率常數分別為0.014 6、0.015 5、0.012 3 1/h，在肌肉中消除最快，其次是血淋巴、肝胰腺。溫度較高時，加快了各組織中環丙沙星的消除。除血淋巴外，肌肉和肝胰腺中的達峰時間在25 ℃ 時( 0.25 h、2 h)比18 ℃ (8 h、12 h)快，血淋巴、肌肉、肝胰腺在25 ℃時的清除率也比18 ℃快。試驗中發現，環丙沙星的濃度比恩諾沙星的濃度要低得多，水溫18 ℃和25 ℃下血淋巴中環丙沙星和恩諾沙星的AUC比值分別為0.8%和0.5%，這與大菱鲆(口灌)[7]和鯽(注射和口灌)[16]中的結果相似。肝胰腺中環丙沙星的比值要比血淋巴、肌肉中高，這種現象也存在于中華絨螯蟹中[13]。藥物主要代謝產物所占的比例在一定程度上體現動物對該藥的代謝強度[20]，且與水溫成正比[17]。試驗中環丙沙星呈不規則衰減的方式，可能受恩諾沙星代謝的影響[21]。

3.3 休藥期

由于恩諾沙星在克氏原螯蝦的肝胰腺中代謝較慢，同時要不斷轉化為環丙沙星，因此把肝胰腺作為藥物殘留的靶器官。在2019年發布的《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中，規定的最大殘留限量為0.2 μg/g(恩諾沙星+環丙沙星)[18]；日本則規定恩諾沙星最高殘留限量為0.01 μg/g。以0.2 μg/g為殘留標準，利用軟件WT 1.4計算出本試驗中25 ℃水溫時恩諾沙星在肝胰腺達到殘留標準需要311.470 0 h，18 ℃水溫時恩諾沙星在肝胰腺達到殘留標準為417.770 0 h。以0.01 μg/g為殘留標準，利用軟件WT 1.4計算出本試驗中25 ℃時恩諾沙星在肝胰腺達到殘留標準為490.640 0 h，18 ℃時恩諾沙星在肝胰腺達到殘留標準為680.580 0 h。制定休藥期不僅要考慮殘留量，還要考慮水溫等狀況[22]。根據本試驗結果，按照國家標準0.2 μg/g為殘留標準，建議休藥期為325 (℃·d)。以日本0.01 μg/g為殘留標準，建議休藥期為511 (℃·d)。