克氏原螯蝦PcDsx基因的克隆及表達分析

石林林，陳家豪，石瑞雪，費佳敏，張龍，李艷和,2

1.華中農業大學水產學院/農業農村部淡水生物繁育重點實驗室/農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心，武漢 430070

Doublesex(Dsx)最早在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaste)中發現，是果蠅性別決定級聯通路下游的兩性基因。該基因與秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的性別決定基因Maleabnormal-3(Mab-3)及其同源基因均屬于Dmrt基因家族(doublesex and Mab-3 related transcription factor)，它們編碼的蛋白均含有1個保守的DM(double-sex and mab-3)結構域[1-2]。性別決定機制的進化過程十分迅速，但Dmrt家族是個例外，它參與了從無脊椎動物到人類的性別發育，是一個保守性較高的古老的性別調控基因家族。Dsx在昆蟲性別決定的整個級聯通路中最為保守，因此，Dsx常被作為其他昆蟲及昆蟲以外的動物性別決定和分化研究的突破口。

甲殼綱動物被認為與昆蟲綱動物有著較近的進化關系，昆蟲類性別決定機制的研究發現給甲殼動物性別調控相關的研究人員帶來了新思路。目前，研究者已對多種甲殼動物的Dsx及同源基因進行了研究。研究者在大型溞(Daphniamagna)中獲得了Dmrt93B基因，發現其只在精巢中表達[3]；此外，還獲得Dsx基因，其中Dsx1已被確定為環境性別決定過程中調控大型溞雄性特征發育的決定基因[4]。在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)中，克隆出了Dmrt11E基因，發現其在精子發生過程中可以定位到精原細胞和精子中[5]。在東方刺龍蝦(Sagmariasusverreauxi)中還發現了1個Y連鎖的含有DM結構域的基因(iDMY)，是常染色體上iDmrt1的刪減版本，該基因可能通過顯性負效應調控常染色體上iDmrt1基因的功能而發揮性別決定與分化的作用[6]。

克氏原螯蝦(Proambausclarkii)，俗名淡水小龍蝦，是我國重要的淡水蝦類養殖品種。因其獨特的風味，較高的營養價值，深受人們的喜愛，被稱為夏季消費的“網紅”。克氏原螯蝦整體產業在我國具有非常重要的經濟地位，2018年，全國小龍蝦養殖總面積達112萬hm2，其主要養殖方式為稻田養殖(84萬hm2)和池塘養殖(近20萬hm2)，養殖總產量達163.87萬t，經濟總產值達3 690億元(中國小龍蝦產業發展報告https://www.360kuai.com/pc/90bd39d9c1a16c541?cota=3&kuai_so=1&sign=360_57c3bbd1&refer_scene=so_1)。克氏原螯蝦單性養殖模式的實現，有助于提高經濟效益；同時還可以作為其傳播的一道防線，降低養殖過程中逃逸蝦在外界環境中泛濫孳生，從一定程度上對生態環境起到保護作用。

性別決定和性別分化機制的了解是實現單性選育的基礎。目前，克氏原螯蝦性別調控相關基因的研究，除了胰島素樣促雄性腺激素基因(insulin-like androgenic gland hormone gene,IAG)[7]外，未見有其他報道。因此，本研究利用RACE技術從克氏原螯蝦中獲得了PcDsxcDNA，并利用qRT-PCR檢測該基因在成年克氏原螯蝦不同組織及早期發育階段不同時期的表達情況，以期為甲殼動物性別調控機制的研究提供理論基礎，為克氏原螯蝦的單性選育提供理論和技術指導。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

試驗所用克氏原螯蝦來自華中農業大學水產養殖示范基地，養殖水溫20～23 ℃。為了解克氏原螯蝦Dsx基因的表達特征，采集成年克氏原螯蝦(雌、雄)個體的神經、腦、心臟、肝胰腺、腸、觸角腺、肌肉、鰓、血細胞、皮膚、性腺等組織，收集克氏原螯蝦無節幼體期、蚤狀幼體期的受精卵及出膜后1、3、6、13、15、17、23、28、41、48、98、103、109、115 d的克氏原螯蝦頭胸甲樣品(n=5)。所有的樣品保存于RNA保存液中，用于后續RNA提取。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

取得的RNA組織樣品用TRIZol法(QIAGEN，德國)提取總RNA，用Thermoscientific DNase I(RNase-free)試劑盒除去基因組DNA后，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)說明書反轉錄成cDNA。

1.3 克氏原螯蝦PcDsx基因克隆

克氏原螯蝦PcDsx基因的cDNA部分序列從筆者所在實驗室測得的克氏原螯蝦Survey序列中獲得[8]，利用Primer 5軟件設計特異性引物PcDsx F/R，然后，根據獲得的cDNA部分序列按照SMARTer? RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa，日本)的說明書設計擴增3′和5′端序列的引物，并反轉錄特異性cDNA模板，擴增PcDsx3′和5′端序列。以上引物均由武漢擎科創新生物科技有限公司合成，擴增PcDsxcDNA序列所用引物信息詳見表1。

表1 實驗所用引物信息表 Table 1 Primer used in the experiment

1.4 生物信息學分析

將測得的序列修剪后進行拼接(DNASTAR Lasergene，USA)，拼接后的序列用在線軟件 ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和Blast (NCBI,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，用DTU Bioinformatics (http://www.bioinformatics.dtu.dk/)和ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)推導其氨基酸序列，并分析其蛋白分子質量和等電點，通過SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測結構域。用在線軟件I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)預測蛋白的三維結構。各物種的同源氨基酸序列來自NCBI，在MEGA 5.1軟件上，用clustalW法對各物種Dsx DM結構域氨基酸序列進行比較分析，并用鄰接法(NJ)構建系統進化樹，各物種Dsx DM結構氨基酸序列如表2所示。

表2 序列比對及建樹所用的Dsx/Dmrt氨基酸序列信息 Table 2 The sequences information of Dsx/Dmrt used in sequence alignment and phylogenetic tree analysis

1.5 qRT-PCR

通過qRT-PCR檢測克氏原螯蝦PcDsx的表達情況。反應體系為20 μL，包括F/R引物(10 μmol/L)各0.2 μL、雙蒸水8.6 μL、cDNA模板1 μL和SYBR Green(TaKaRa，日本)10 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s 57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。18S-RNA作為內參基因,用2-ΔΔCt法計算PcDsx的相對表達量。

1.6 數據分析

試驗數據在Microsoft Excel 2016軟件上進行統計，所有試驗數據均以平均數±標準差(mean±SD)表示，在SPSS 23.0 軟件上進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用LSD法進行多重比較檢驗差異顯著性，以字母或“*”代表差異顯著性(P<0.05)，用軟件GraphPad Prism 7 作圖。

2 結果與分析

2.1 克氏原螯蝦PcDsx 基因的克隆

從精巢組織中獲得了PcDsxcDNA全長序列(1 584 bp)，包括243 bp 5′ UTR、765 bp ORF(編碼254 aa)和576 bp 3′ UTR(圖1)。該基因的3′ UTR區有2個mRNA快速降解信號(ATTTA)，在降解信號之后有1個GT富集和2個“TTTTTT”(圖1)。該基因編碼的蛋白有254 aa，相對分子質量和等電點分別為28 559.80和6.46，預測的PcDsx蛋白含有1個N-糖基化位點(N78)和1個由55個氨基酸殘基組成的DM結構域，其二級結構和三維結構如圖2所示。

利用MEGA 5.1軟件將表2中所有基因的DM結構域氨基酸進行多重序列比較及進化樹分析，結果如圖3A和圖3B所示。克氏原螯蝦PcDsx與南美白對蝦(Penaeusvannamei)Dmrt1-like、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)PchDsx、東方刺龍蝦SvDsx的 DM結構域有5個保守的半胱氨酸殘基(C)，可以形成一個鋅結合位點(CCHC)，在進化樹中其蛋白也聚為一支，其中PcDsx與SvDsx的同源性最高；而果蠅和豐年蟲(Artemiafranciscana)的Dsx以及甲殼類、哺乳類Dmrt的DM結構域則有6個保守的半胱氨酸殘基(C)，可以形成2個鋅結合位點(CCHC和HCCC)，而其蛋白與PcDsx的同源性也較遠(圖3B)。

2.2 PcDsx在成年克氏原螯蝦各組織中的表達情況

PcDsx在成年雌雄克氏原螯蝦不同組織中的表達情況如圖4所示，在成年雄性克氏原螯蝦中，觸角腺中PcDsx表達量最高，其次是食道下神經節、肌肉組織、精巢、心臟，其他各組織PcDsx表達相對較低，尤其在血和皮膚中；在成年雌性克氏原螯蝦中，PcDsx表達量最高的組織亦是觸角腺，其次是卵巢、肝胰腺、后腸和肌肉。此外，除了食道下神經節、腦、肌肉組織、精巢、心臟和血中的PcDsx表達水平在雌雄個體間不存在差異，其他組織中PcDsx的表達在雌雄個體間均有顯著性差異，其中，在雌性的觸角腺、卵巢、肝胰腺、前腸、中腸、后腸、鰓和皮膚中表達水平顯著性高于雄性組織。

起始密碼子(ATG)用紅色字體表示，終止密碼子(TGA)用紅色字體及下方加*表示；mRNA快速降解信號(ATTTA)用黃色表示；GTF富集和TTTTTTT用藍色表示。預測的N-糖基化位點用綠色斜體字體表示，DM(doublesex DNA-binding motif)結構域用斜體加下滑線表示。The start codon (ATG) was marked with red,and the stop codon (TGA) was marked with red and indicated with “*”. The mRNA rapid degradation signal (ATTTA) was shown in yellow. GT-rich and “TTTTTT” were marked with blue. Predicted N-glycosylated sites were indicated in green italic font. The deduced doublesex DNA-binding motif (DM) sequences were indicated by itlics and underlined.

A:預測的PcDsx蛋白結構域。“DM”表示DM結構域，紅色區域為低復雜度區域。B:預測的PcDsx蛋白三維結構圖。A:The Predicted domains of PcDsx. “DM” indicates doublesex DNA-binding motif,and red box indicates low complexity region. B:The predicred three-dimensiona structure of PcDsx.

2.3 PcDsx在克氏原螯蝦早期發育不同時期的表達情況

PcDsx在克氏原螯蝦早期發育不同時期的表達情況如圖5所示。從無節幼體期開始PcDsx的表達水平逐漸升高，在出膜后1～3 d出現高峰，此后，PcDsx的表達水平逐漸降低，在可以通過外部結構鑒別雌雄(出膜后23 d)后，雌性幼蝦中PcDsx的表達水平在出膜后41 d最高，在出膜后98 d次之，而在雄性幼蝦中PcDsx表達水平在出膜后115 d 最高，在出膜后109 d次之。有意思的是，在出膜后23 d，雌性幼蝦中PcDsx表達水平明顯高于雄性，在出膜后41、98、103 d亦是如此；而在出膜后28、48、109 d 和115 d則是雄性幼蝦明顯高于雌性。

A:Dsx/Dmrt DM結構域的多重比較分析，多序列比較的方法為clustal W法，保守性大于50%的氨基酸殘基用彩方形背景突出。B:Dsx/Dmrt DM結構域的進化分析。在MEGA 5.1軟件上采用 Neighbor-Joining法構建進化樹，bootstrap值設置為1 000次計算重復；克氏原螯蝦加紅色方框標記。多重比較及建樹所用 Dsx或Dmrt相關序列信息見表2。A:Multiple alignment analysis of Dsx/Dmrt DM domains. The alignment was performed by the clustal W algorithm. The identical residue sites in regions with more than 50% conserved level were highlighted with a colored square background. B:Evolutionary analysis of Dsx/Dmrt amino acid sequences. The analysis was constructed by the Neighbor-Joining method with bootstrapping 1 000 replicates,using MEGA 5.1 software. P. clarkii was marked with a red box. The Dsx/Dmrt related information used for multiple alignment and evolutionary analysis were listed in Table 2.

VG：腹部腹神經索 Ventral ganglia；TG：胸部腹神經索 Thoracic ganglia；SG：食道下神經節Subesophageal ganglia；PN：圍食道神經 Periesophageal nerve；Br：腦Brain；Hea：心臟Heart；Hep：肝胰腺Hepatopancreas；FG：前腸 Foregut；MG：中腸Midgut；HG：后腸Hindgut；AnGl：觸角腺Antennary glands；Mu：肌肉Muscle；Gi：鰓Gill；Hem：血Hemocytes；Hy：皮膚Hypodermis；Te：精巢Testis；Ov：卵巢Ovary；TD：輸精管Testicular ducts；AG：促雄性腺Androgenic gland； *： P <0.05；**：P<0.01。PcDsx在成年雄性克氏原螯蝦各組織中表達的顯著性差異用大寫字母表示(P<0.05)，PcDsx在成年雌性克氏原螯蝦各組織中表達的顯著性差異用小寫字母表示(P<0.05)，PcDsx在雌雄相同組織中表達的顯著性差異用星號表示。Different upper-case letters indicated significant differences in the expression levels of PcDsx in different tissues of male P. clarkii (P<0.05). Different lower-case letters indicated significant differences in the expression levels of PcDsx in different tissues of female P. clarkii (P<0.05). Asterisks indicated significant differences in the expression levels of PcDsx between male and female the same tissue.

NS：無節幼體期 Nauplius stage； ZS：蚤狀幼體期 Zoea stage；1-115 d： 出膜后第1～115天The first-115 days after hatching.

3 討 論

在本研究中，我們獲得了PcDsxcDNA的全長序列，該基因具有Dmrt基因家族的特征，與同源性較高的南美白對蝦Dmrt1-like、中國明對蝦PchDsx、東方刺龍蝦SvDsx的 DM結構域相同，都只含有1個鋅結合位點(CCHC)，而同源性較遠的果蠅和豐年蟲的Dsx以及甲殼類和哺乳類Dmrt的DM結構域則含有2個鋅結合位點(CCHC和HCCC)。在PcDsx中發現了2個降解信號，降解信號會影響mRNA的穩定性，不知該基因的mRNA的穩定性在雌雄克氏原螯蝦間是否有差異，進而影響其在不同性別的克氏原螯蝦中的功能。

在東方刺龍蝦中，對性發育相關基因SvTKIR和SvDmrt1的研究發現，這2個基因在雌雄未成年蝦的觸角腺中表達水平均較高，而在成年蝦的觸角腺中的表達則表現出性別二態性，雌性中的表達水平顯著高于雄性[9]。在本研究中，PcDsx在成年雌性克氏原螯蝦的觸角腺組織中表達水平最高，且表達水平顯著高于雄性，筆者所在研究小組在對克氏原螯蝦PcSxl的研究中發現，該基因在成年雄蝦觸角腺組織中表達最高，而在雌性中的表達遠低于雄性(數據待發表)。目前，尚無法解釋這些基因在觸角腺中的性別二態性表達現象。觸角腺在蝦蟹類中的作用類似于哺乳動物的腎臟，用于調節滲透壓和離子平衡以及代謝廢棄物如尿液的排泄。有證據表明尿液中混有獨特的物質，可以傳達社會地位、交配、聚合退敵、協調公共生活及其他社會行為的化學信號[10-12]，如若觸角腺參與這些信號或者交配信號的調節過程，那么這些基因在觸角腺中表現出性別二態性表達也有據可依[9]，但目前未見相關報道，尚需進一步深入研究。

在甲殼動物中，有的與昆蟲性別決定通路上的基因的同源基因，其表達水平對性別具有偏好性，例如，Sxl多具有偏雄性表達的特點，日本沼蝦(M.nipponense)[13]和中華絨蟹(Eriocheirsinensis)[14]如此，南美白對蝦中的Sxl-1、Sxl-3、Sxl-5和Sxl-6[15]亦是如此。日本沼蝦中Fem-1和Fem-1b[16-17]的表達對性別也具有偏好性。甲殼動物性別調控機制具有復雜多樣性，性別偏好性表達現象在不同物種中可能不盡相同，如淡水枝角水溞(D.pulex)中的Tra基因[18]和中國明對蝦中的Tra-2基因[19]的表達存在性別二態性，而大型溞中的Tra[20]和斑節對蝦(P.monodon)中的Tra-2[21]在雌雄間表達則并無明顯差異；本研究中PcDsx在雌性克氏原螯蝦的卵巢組織中的表達水平高于雄性精巢，而同源性較高的中國明對蝦Dsx以及長牡蠣Dsx則在雄性性腺中高表達[22-23]。

IAG是目前唯一被證實參與雄性甲殼動物性別分化的關鍵因子[24-25]，其可能與Dsx間存在直接或間接的調節關系。在羅氏沼蝦中，Dmrt11E基因的沉默會引起IAG轉錄水平下調[5]，同樣的，在中國明對蝦中，dsRNA干擾Dsx基因的表達后，也會使IAG基因表達水平下降，并且在IAG啟動子區域上預測出了Dsx結合位點，推測Dsx基因可能是IAG基因上游調節基因[22]。根據PcDsx和PcIAG在克氏原螯蝦早期發育時期的表達情況分析，推測PcIAG基因在直接或間接接收到PcDsx的調節信號后做出相應的反應，在出膜后1～3 d 表達水平達到最高，進而調控克氏原螯蝦的雄性第二性征，在出膜后23 d長出雄性特化的第一游泳足，至于克氏原螯蝦性別形成的時間我們無法判斷，還有待于深入研究。