油棕葉肉原生質體分離及瞬時轉化體系的建立

王一菲，劉新星，張青，鄭育聲，李東棟

海南大學熱帶作物學院,海口 570228

油棕(ElaeisguineensisJacq.)是棕櫚科單子葉熱帶植物，它主要生產2種棕櫚油和棕櫚仁油，占世界油量的36%[1]。其中，棕櫚油含有棕櫚酸、油酸、維生素E和類胡蘿卜素，具有極高的營養價值[2]。應用基因工程手段鑒定油棕中與油脂代謝相關基因的功能，進而對其脂肪酸種類和含量進行遺傳修飾，對提高棕櫚油的產量及改善其品質具有重要的價值。

然而，作為多年生木本植物，油棕植株再生體系周期很長，轉基因植株也不易獲得。因此，研究者通常將油棕基因異源表達于模式植物如擬南芥中，以研究其功能。但由于遺傳背景差別太大而無法取得滿意的效果。原生質體瞬時轉化系統快速、高效，被廣泛用于亞細胞定位、蛋白與蛋白之間的互作、蛋白與啟動子之間的特異性結合等研究[3]。利用油棕原生質體進行基因的同源表達，將有效避免異源表達可能造成的差異結果。

目前，油棕原生質體的分離[4-6]及瞬時轉化[7]雖然有過報道，但其原材料都是油棕胚性懸浮細胞。然而由胚性愈傷到胚性懸浮細胞要3個月[4]，耗時長。因此，本研究以油棕試管苗葉片為原材料，分離得到原生質體，并借助綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白，對油棕葉肉原生質體的雙質粒瞬時共轉化體系進行優化，旨在為油棕基因的同源表達、功能鑒定及蛋白質與DNA、蛋白質與蛋白質之間的互作研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

油棕(ElaeisguineensisJacq.)試管苗幼嫩葉片(發芽后25 d)，以海南大學熱帶棕櫚植物實驗室誘導獲得的油棕愈傷組織為基礎，通過芽誘導獲得幼嫩植株。綠色熒光蛋白載體pGreen Ⅱ 62-SK-EGFP和紅色熒光蛋白載體pGreen Ⅱ 0800-DsRed2載體皆購買于優寶生物公司。纖維素酶、離析酶、MES酸和BSA購自Solarbio公司，甘露醇、PEG4000、氯化鎂等購自西隴科學公司。

1.2 油棕葉肉原生質體的分離

油棕葉肉原生質體分離參照擬南芥葉片原生質體的分離方法[8]，稍有改動。將幼嫩油棕試管苗葉片切成0.5 mm寬的細絲，浸沒于15 mL過濾除菌后的酶解液中。酶解液的配方為：30 g/L的纖維素酶、8 g/L的離析酶、0.4 mol/L的甘露醇、20 mmol/L 的氯化鉀、20 mmol/L 的MES、10 mmol/L的氯化鈣和1 g/L的BSA。然后在室溫、避光、轉速為60 r/min的條件下孵育3.5 h。再將其用80 μm的細胞過濾篩過濾到離心管中，加入20 mL的洗液(30 g/L KCl、5 g/L CaCl2·2H2O和36 g/L 甘露醇，pH 5.6)，2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清。最后加入適量的懸浮液(30 g/L KCl和36 g/L甘露醇，pH 5.6)重懸原生質體，使原生質體的量為4×105/mL。

1.3 油棕葉肉原生質體的瞬時轉化

油棕葉肉原生質體的轉化方法參照文獻[7]進行并有稍許改動。取200 μL的油棕原生質體(4×105/mL)于2 mL 的離心管，加入10 μg 的pGreen Ⅱ 62-SK-EGFP質粒和10 μg的 pGreen Ⅱ 0800-DsRed2質粒，混勻，冰上靜置30 min后，45 ℃熱激5 min，再于冰上靜置2 min。然后室溫黑暗孵育30 min，轉移混合液于6孔板中。加入等量的PEG/Mg2+溶液(100 g/L 的PEG 4000和50 g/L的氯化鎂)，于黑暗中靜置孵育10 min。然后再加入4 mL的洗液(30 g/L KCl、5 g/L CaCl2·2H2O和36 g/L甘露醇，pH 5.6)，室溫弱光誘導16 h，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，棄上清，加200 μL的洗液重懸原生質體，在熒光倒置顯微鏡下觀察并計算轉化效率。

為了獲得更高的轉化效率，對轉化條件進行梯度設置：pGreen Ⅱ 0800-DsRed2質粒質量設置為1.25、2.50、5.00和10.00 μg，45 ℃熱激時間設置為5、10、15、20和25 min，PEG/Mg2+溶液中PEG 4000的質量濃度設為100、200、400和600 g/L，氯化鎂的質量濃度設為50、100、200和300 g/L，加入PEG/Mg2+溶液后孵育時間設為10、20和30 min，最后加入的洗液體積為2和4 mL。

1.4 轉化效率的計算

轉化效率參照Masani等[7]的方法計算。油棕葉肉原生質體的轉化完成后，取原生質體于熒光倒置顯微鏡下觀察。轉化效率=(發出熒光的原生質體數目/總原生質體個數)×100%。

1.5 統計學分析

每個樣本3個平行。所有數據利用SPSS軟件進行顯著性分析。2組數據間的差異性檢驗方法為“獨立樣本t檢驗”，多組數據間的差異性檢驗方法為“Duncan’s multiple range test”。

2 結果與分析

2.1 油棕葉肉原生質體的分離

以再生1個月內的油棕幼芽葉片(圖1A)為原材料，按本文“1.2”的方法進行操作，得到油棕葉肉原生質體(圖1B)。

A. 油棕試管苗幼葉 Young leaves of oil palm plantlet； B. 油棕葉肉原生質體 Oil palm mesophyll protoplasts.

2.2 油棕葉肉原生質體瞬時轉化體系的優化

1)質粒含量對油棕葉肉原生質體轉化效率的影響。將10 μg的綠色熒光蛋白質粒pGreen Ⅱ62-SK-EGFP分別和1.25、2.50、5.00、10.00 μg的紅色熒光蛋白質粒pGreenⅡ 0800-DsRed2，按照本文“1.3”的方法，共轉入相同含量的原生質體中，計算轉化效率，結果(圖2A)顯示，轉化效率隨質粒pGreen Ⅱ 0800-DsRed2含量的降低而升高，當pGreen Ⅱ62-SK-EGFP質粒為10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2質粒為1.25 μg時，轉化效率最高，為0.068%。

2)PEG/Mg2+溶液的誘導時間對油棕葉肉原生質體轉化效率的影響。為了研究加入PEG/Mg2+溶液的孵育時間對轉化效率的影響，將10 μg的pGreenⅡ62-SK-EGFP質粒和1.25 μg的pGreen Ⅱ 0800-DsRed2質粒共轉入油棕葉肉原生質體，對PEG/Mg2+溶液的誘導時間梯度設置為：10、20和30 min。結果顯示，當誘導時間為20 min時，轉化效率最高，為0.418%(圖2B)。

3)PEG 4000質量濃度對油棕葉肉原生質體轉化效率的影響。在PEG誘導的原生質體的轉化體系中，PEG質量濃度是影響轉化效率的重要因素之一，在質粒含量和PEG/Mg2+溶液的誘導時間都是最優的條件下，檢測了PEG/Mg2+溶液中的PEG4000的質量濃度(100、200、400和600 g/L)對轉化效率的影響。結果顯示，當PEG 4000的質量濃度為200 g/L時，轉化效率最高，為0.500%，過低或過高濃度的PEG 4000都會使轉化效率降低(圖2C)。

4)熱激時間對油棕葉肉原生質體轉化效率的影響。結果(圖2D)顯示，在其他轉化條件皆相同，熱激時間分別為5、10、15、20和25 min時，轉化效率先是隨著熱激時間的增加而降低，當熱激時間為10 min時，轉化效率比熱激時間為5 min的低；然而當熱激時間再延長，轉化效率隨之升高，且熱激時間為20 min時，轉化效率達到最高，為0.528%；最后，當熱激時間為25 min時，轉化效率最低。

5)氯化鎂質量濃度對油棕葉肉原生質體轉化效率的影響。在質粒含量、PEG/Mg2+溶液的誘導時間、PEG4000質量濃度和熱激時間都為最優的條件下，檢測了氯化鎂的質量濃度分別為50、100、200和300 g/L時原生質體的轉化效率。從圖2E可見，當氯化鎂的質量濃度為100和200 g/L時，轉化效率最高，為2.85%，為了節約成本，選擇100 g/L進行后續實驗。

6)過夜培養時液體體積對油棕葉肉原生質體轉化效率的影響。在其他條件都為最優的情況下，進行了油棕葉肉原生質體的轉化，然后分別加入2和4 mL的洗液進行過夜培養。結果發現當加入2 mL洗液時，轉化效率最高，為4.82%(圖2F)。

不同小寫字母表示經Duncan’s multiple range test檢驗差異顯著。2組數據間的差異性檢驗方法為“獨立樣本t 檢驗”：”*”表示顯著性差異(P<0.05 )； “**”表示極顯著性差異(P< 0.01)。Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) using Duncan’s multiple range test. “*” and “**” indicated significant differences (P<0.05) or (P<0.01) using independent-samples t test.

washing solution(F ) on transient transformation efficiency of oil palm mesophyll protoplasts

2.3 最優條件下油棕葉肉原生質體瞬時轉化

在最優條件下即pGreenⅡ 62-SK-EGFP質粒為10 μg、pGreenⅡ 0800-DsRed2質粒為1.25 μg、45 ℃的熱激時間為20 min、PEG/Mg2+溶液中的PEG 4000質量濃度為200 g/L、氯化鎂的質量濃度為100 g/L、加入PEG/Mg2+溶液后的孵育時間為20 min，最后加入的洗液的體積為2 mL進行了油棕葉肉原生質體轉化， 熒光倒置顯微鏡觀察結果(圖3)顯示，GFP和RFP都正常表達在整個原生質體中，證明此油棕葉肉原生質體的雙質粒共轉化體系可行。

圖3 雙質粒共轉化油棕葉肉原生質體

3 討 論

原生質體由于沒有細胞壁，更易于接受外源DNA，且瞬時表達周期短，能更快地獲得實驗數據，常被用于亞細胞定位、實時監測胞內生化反應、qRT-PCR檢測基因的表達模式、驗證蛋白質與蛋白質或蛋白質與DNA的互作等，對鑒定植物基因的功能有著重要意義[9]。Bai等[10]利用大麥原生質體進行了亞細胞定位，發現OsSPCH定位于細胞核，OsLrgB定位于葉綠體；同時利用qRT-PCR檢測了共轉miR393a和其靶基因后的大麥原生質體中靶基因的表達水平，從而證明了兩者間的靶向關系。Lin等[11]利用植物原生質體檢測了CRISPR/Cas9的誘變效率；同時以煙草原生質體為材料，利用CRISPR/Cas9對NtPDS進行靶向突變，最終獲得突變后的再生植株。Liu等[12]通過擬南芥原生質體瞬時轉化體系，鑒定出BnWRKY15和BnWRKY33都定位于細胞核；同時借助雙螢光素酶報告系統，發現BnWRKY15在擬南芥原生質體中，能抑制BnWRKY33的反式激活能力。Menzel等[13]在擬南芥葉肉原生質體中通過免疫印跡法檢測了flg22處理對PIP5K6磷酸化的影響。

以往報道的油棕原生質體的分離大都是油棕細胞培養物，且多用于植株再生。Bass等[5]從油棕細胞培養物中分離出原生質體，經培養后再生出細胞壁。Sambanthamurthi等[6]從多胚培養物中分離出原生質體，并培養得到微小愈傷組織。Masani等[4]由細胞懸浮培養物分離得到原生質體，并再生成植株。Masani等[7]還報道了來源于細胞懸浮培養物的原生質體的單個質粒瞬時轉化體系，轉化效率為4.76%。但是，獲得油棕胚性愈傷需要5～10個月，由胚性愈傷到胚性懸浮細胞則又要花費3個月[4]。以細胞懸浮培養物為原材料分離原生質體將會拖慢實驗進程。而油棕葉片是最為容易獲得的材料，因此，本研究以油棕試管苗葉片為原材料，分離原生質體，整個過程僅需5 h。與擬南芥葉肉原生質體的分離相比[8]，油棕葉片所用酶解液中的纖維素酶和離析酶為擬南芥的2倍，可能與木本植物結構更為復雜、組織間內含物更豐富有關[14]。

分離得到油棕葉肉原生質體后，考慮到大多數實驗需要同時轉入2個基因，以驗證兩者間的關系，本研究按照Masani等[7]報道的最優體系將2個質粒(各10 μg)共轉入原生質體中，然而轉化效率極低，僅有0.028%(圖2A)，這可能是由于原生質體來源于葉片而非懸浮細胞，且轉入質粒為2個。Peng等[15]發現熱激處理有利于提高秈稻原生質體瞬時轉化的效率。本研究中，當熱激時間為20 min時，油棕葉肉原生質體轉化效率達到最高，縮減或延長熱激時間都會使轉化效率降低。在PEG介導的原生質體轉化中，質粒的質量比、PEG濃度、PEG誘導時間對轉化效率具有重要影響。當pGreen Ⅱ62-SK-EGFP質粒為10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2質粒為1.25 μg時，油棕葉肉原生質體的轉化效率最高。高分子質量的PEG溶液對原生質體有毒害作用[16]，而PEG濃度過低，會導致轉化效率過低，因此，PEG濃度是優化原生質體轉化的關鍵因素。本研究中油棕葉肉原生質體轉化的最適PEG4000質量濃度為200 g/L、誘導時間為20 min。Lazzeri等[17]發現，與Ca2+相比，Mg2+對PEG介導的轉化有更好的促進作用。本研究對氯化鎂的質量濃度進行了優化，發現其最適質量濃度為100 g/L。此外，由于過夜孵育前，加入的洗液體積會直接影響到PEG、Mg2+的最終濃度，且此濃度下的PEG和Mg2+將與原生質體一同孵育16 h，分別檢測了加入2 mL和4 mL時，油棕葉肉原生質體的轉化效率，發現加入2 mL時，效率更高。然而，世界范圍內，鮮少報道油棕原生質體的瞬時轉化，與模式植物擬南芥相比，油棕原生質體的瞬時轉化體系尚不成熟。本研究在最優組合條件下，轉化效率為4.82%，遠低于大麥(83%)[10]、擬南芥(90%)[18]、水稻[19](53%～75%)等體系。

本研究以油棕試管苗葉片為原材料，在酶解液中的纖維素酶為30 g/L、離析酶為8 g/L時，分離得到了油棕葉肉原生質體，并對雙質粒瞬時共轉化體系進行了優化。最優轉化條件如下：pGreenⅡ62-SK-EGFP質粒為10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2質粒為1.25 μg，45 ℃的熱激時間為20 min，PEG/Mg2+溶液中的PEG 4000的質量濃度為200 g/L、氯化鎂的質量濃度為100 g /L，加入PEG/Mg2+溶液后的孵育時間為20 min，最后加入的洗液體積為2 mL。此瞬時轉化體系為油棕基因的同源表達提供了可能，可以用于亞細胞定位、蛋白質與DNA或蛋白質互作、基因表達模式等研究，有效地縮短了試驗周期，為油棕基因的功能驗證提供了一種新的手段。