利用宏基因組測序確診肺結核及非結核分枝桿菌肺病各一例報道并文獻復習

馬瀟梟，高寶安，牟干，劉玲

結核病及非結核分枝桿菌（non-tuberculosis Mycobacterium，NTM）肺病是全球重要的公共衛生問題，嚴重威脅著人類的生命健康。病原學檢測結果是臨床診斷結核病及NTM肺病的金標準，然而傳統病原微生物檢測技術面臨著陽性率低、檢測周期長等局限性，不能滿足臨床快速診斷的需求，尤其對那些臨床癥狀及影像學特征不典型、痰抗酸桿菌涂片及培養多次陰性者作用有限，常導致誤診、誤治[1-3]。宏基因組測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）通過直接測定樣本中所有DNA/RNA基因組信息即可實現所有病原菌的鑒定及分型，在復雜性、混合性感染疾病的診治中具有巨大潛力。近年來，mNGS在非典型結核病及NTM肺病診斷中也嶄露頭角[1-2，4]，本文報道了借助mNGS確診的1例結核分枝桿菌及NTM混合感染引起的肺結核患者及1例NTM感染引起的NTM肺病患者的診療經過，并進行相關文獻復習，旨在提高臨床醫生對這兩種疾病的認識、鑒別診斷水平以及對mNGS在復雜感染性疾病病原微生物鑒定中應用的認識。

本文價值：

（1）本文報道了利用近期備受關注的宏基因組測序（mNGS）確診的2例常規病原學檢測陰性的疑難病例，其中1例確診為結核分枝桿菌及非結核分枝桿菌混合感染，1例確診為非結核分枝桿菌肺病。通過病例報道及文獻復習，進一步明確了mNGS在結核分枝桿菌感染及非結核分枝桿菌肺病中的應用價值，開拓了臨床工作者對于疑難危重感染性疾病患者的診療思路。（2）通過對本文患者1的報道，提示在臨床工作中，對常規病原學檢測陰性而高度懷疑結核分枝桿菌感染的患者要反復行病原學檢測；胸腔積液、外周血mNGS結果的迥異可能提示胸腔積液中結核分枝桿菌含量較低，外周血結核分枝桿菌檢測也可能成為一種重要補充。（3）通過追蹤患者2的診療全過程及結局，提升了臨床工作者對非結核分枝桿菌肺病的重視，展示了mNGS在非結核分枝桿菌肺病診療中的優勢。

1 病例簡介

患者1，男，91歲，2020-05-04因“咳嗽、咳痰伴氣促4個月，發熱2 d”就診于宜昌市中心人民醫院。現病史：患者4個月前受涼后出現咳嗽、咳痰，咳白色黏痰，痰多不易咳出，伴活動后胸悶氣促，無乏力、盜汗、消瘦，無胸痛、心悸、咯血，胸部CT檢查提示“左下肺少許感染，左側胸腔積液，慢性支氣管炎”。2020-01-25，新型冠狀病毒核酸檢測陽性，于宜昌市第三人民醫院住院治療，2020-02-03及2020-02-05復查新型冠狀病毒核酸檢測陰性，好轉出院。院外仍有間斷咳嗽咳痰、活動后胸悶氣促?；颊? d前無明顯誘因出現發熱，測體溫最高達37.8 ℃，伴咳嗽、咳痰，咳少量白色黏痰，偶有胸悶氣促，活動后明顯，無畏寒、寒戰，無鼻塞流涕、咽痛、胸痛、咯血；為求進一步診治來本院。既往史：有慢性支氣管炎病史多年；3個多月前診斷為新型冠狀病毒肺炎，已治愈。有高血壓病史4年，最高血壓180/100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），給予口服苯磺酸左氨氯地平片進行降壓治療，血壓控制情況不詳；有冠心病病史4年；2016年于武漢行冠狀動脈支架植入術，并口服阿司匹林及辛伐他汀進行治療；否認結核病及其他特殊疾病病史。體格檢查：雙肺呼吸音粗，左下肺呼吸音消失，右肺未聞及干、濕啰音，無胸膜摩擦音；余無特殊。2020-05-01曾于本院門診行胸部CT檢查，結果示：考慮左肺滲出或感染，左側胸腔積液較前增多，左肺膨脹不全，慢性支氣管炎，見圖1A～D。心電圖示：心房撲動；胸導聯R波遞增不良。床邊心臟彩色多普勒超聲檢查示：雙心房增大，左房室瓣輕度反流，右房室瓣中-重度反流。2020-05-04實驗室檢查示：紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）50 mm/1 h（參考范圍0～43 mm/1 h），D-二聚體1.93 mg/L（參考范圍0～0.50 mg/L），血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）14.05 mmol/L（參考范圍3.60～9.50 mmol/L），肌酐（creatinine，Cr）128 μmol/L（參考范圍57～111 μmol/L），C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）60.1 mg/L（參考范圍0～10.0 mg/L），降鈣素原（procalcitonin，PCT）＜0.05 μg/L（參考范圍0～0.05 μg/L），N末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）1 544 ng/L（參考范圍0～125 ng/L）；痰抗酸染色涂片、痰細菌/真菌培養、血培養無陽性結果，血常規、肝功能、電解質、心肌酶譜、甲型/乙型流感病毒抗原、支原體/衣原體免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗體、尿常規、便常規、抗可溶性抗原抗體、抗中性粒細胞胞質抗體未見明顯異常。2020-05-05行胸腔穿刺引流術，胸腔積液常規檢查示：黃色渾濁，蛋白定性試驗陽性，有核細胞計數1 741×106個/L，中性粒細胞分數0.08，單核細胞分數0.03，淋巴細胞分數0.87，間皮細胞分數0.02；胸腔積液生化檢查示：總蛋白（total protein，TP）56.45 g/L， 清 蛋 白（albumin，Alb）32.81 g/L，乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）412 U/L，腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）47.0 U/L，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）1.0 μg/L，結核分枝桿菌DNA陰性；胸腔積液細胞學檢查：較多淋巴細胞，少量間皮細胞、中性粒細胞。肺癌六項：鱗狀細胞癌相關抗原4.1μg/L（參考范圍0～2.5μg/L），胃泌素釋放肽前體70.4 ng/L（參考范圍0～68.3 ng/L），其余指標處于參考范圍；結核感染特異性T細胞檢測陽性；鑒于患者高齡、基礎狀況差、胸腔積液增多及胸膜增厚原因不明、肺癌標志物稍高，不排除惡性腫瘤可能；2020-05-09正電子發射計算機斷層顯像（PET-CT）示：（1）左側胸膜增厚，代謝增高；心包稍增厚，代謝增高；上述考慮炎性（結核病？）并左側胸腔及心包少量積液。（2）慢性支氣管炎；雙肺結節影，代謝不高，考慮炎癥。（3）右側鎖骨區、雙側腋窩、雙肺門及縱隔淋巴結炎性增生。予以胸腔閉式引流，抗感染藥物頭孢他啶2.0 g、1次/12 h（2020-05-04至2020-05-09），效果欠佳；調整抗生素為莫西沙星0.4 g，1次/d（2020-05-10至2020-05-16）、哌拉西林他唑 巴 坦 3.375 g，1次 /8 h（2020-05-10至 2020-05-19）。2020-05-12胸腔積液mNGS結果（由北京金匙基因科技有限公司提供）示未檢出病原微生物，見表1；2020-05-19復查胸部CT示：左側胸腔積液較前吸收，左肺復張，左側胸膜增厚，見圖1E～H，臨床高度懷疑結核分枝桿菌感染，再次送檢外周血進行mNGS，2020-05-19回報檢出結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuber-culosis complex，MTBC）及堪薩斯分枝桿菌，見表1，考慮結核分枝桿菌及NTM混合感染，轉傳染病醫院進一步治療。

圖1 患者1胸部CT檢查結果Figure 1 Results of chest CT examination in patient 1

患者2，男，56歲，2019-12-06因“畏寒、發熱伴咽痛1 d”就診于宜昌市中心人民醫院?，F病史：患者1 d前受涼后出現畏寒、發熱，測體溫最高達38.5 ℃，發熱時感頭痛、咽痛，伴有肌肉、關節酸痛，偶有咳嗽、咳痰，無鼻塞流涕、胸悶胸痛、咯血，無盜汗、乏力、食欲不振、消瘦，自行口服布洛芬緩釋膠囊，上述癥狀無明顯好轉，為求進一步診治來本院。既往史：有支氣管擴張病史30余年，否認結核病及其他特殊疾病病史。體格檢查：呼吸規整，雙肺呼吸音粗，雙肺未聞及干、濕啰音，無胸膜摩擦音；余無特殊。診療經過：2019-12-06血常規示：白細胞計數（white blood cell count，WBC）10.55×109/L（參考范圍 3.50×109/L～9.50×109/L），中性粒細胞百分比（percentage of neutrophils，NE%）86.7%（參考范圍40.0%～75.0%），淋巴細胞百分比（percentage of lymphocytes，LY%）6.3%（參考范圍20%～50%），CRP 65.27 mg/L，PCT 0.06 μg/L；痰抗酸染色涂片、痰細菌/真菌培養及血培養均無陽性結果，支原體/衣原體IgM抗體陰性，肝腎功能、電解質、心肌酶譜、甲型/乙型流感病毒抗原、凝血功能、便常規及隱血試驗未見明顯異常。2019-12-06胸部CT檢查示：左肺見斑片狀影，左下肺支氣管擴張，考慮感染，結核待排，見圖2A、B。2019-12-11支氣管鏡檢查示：左側支氣管管腔有大量膿性分泌物；左舌葉氣管鏡液基細胞學檢查示：較多纖毛柱狀上皮細胞，少量中性粒細胞、巨噬細胞、基底細胞。氣管刷片細菌/真菌及抗酸染色涂片、肺泡灌洗液細菌/真菌培養、肺泡灌洗液結核分枝桿菌DNA、曲霉菌免疫學檢查未見明顯異常，結核感染特異性T細胞檢測結果處于臨界值、X-pert檢測陰性。予以抗感染藥物莫西沙星0.4 g、1次/d（2019-12-06至2019-12-11），哌拉西林他唑巴坦4.5 g、1次/12 h（2019-12-12至2019-12-18），止咳祛痰（溴己新、氨溴索）等對癥支持治療；2019-12-18復查胸部CT示：與2019-12-06胸部CT檢查結果相比，雙肺斑片狀影較前增多，見圖2C、D。復查支氣管鏡示：黏膜充血水腫，左側支氣管管腔內見膿性黏稠分泌物。行左下葉肺泡灌洗術，肺泡灌洗液抗酸桿菌陽性（+）：3～9條/100視野；遂診斷為肺結核。2019-12-20肺泡灌洗液mNGS結果（由北京金匙基因科技有限公司提供）示檢出膿腫分枝桿菌（見表2），膿腫分枝桿菌基因組覆蓋圖見圖3，修正診斷為NTM肺病，予以抗NTM治療。2020-05-19復查肺部CT示雙肺斑片狀影明顯吸收，見圖2E、F。

2 討論

結核病是全球十大死因之一，是發展中國家沉重的疾病負擔，嚴重威脅著人類的生命健康。世界衛生組織發布的《2019年全球結核病報告》[5]顯示，2018年全球約有1 000萬（范圍為900萬～1 110萬）結核病新發病例，約145萬（范圍為132萬～158萬）患者死于結核病。結核病由MTBC中的細菌感染引起，MTBC在核苷酸水平約有99.9%的相似度，臨床常規微生物實驗室檢查難以精準鑒別，目前已知的MTBC包括人結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、坎納分枝桿菌、非洲分枝桿菌、海豹分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、Caprae分枝桿菌等，結核分枝桿菌是導致人類結核病最主要的病原菌[6-7]。結核分枝桿菌可侵襲人體任何系統器官，臨床以肺部感染最常見，表現為原發性肺結核、血型播散性肺結核、繼發性肺結核、支氣管結核、結核性胸膜炎等。結核病一般臨床診斷并不困難，然而近年隨著糖尿病患者的增多、免疫抑制劑及抗腫瘤藥物應用的增加等，免疫損傷人群明顯增多，肺結核臨床表現越來越多樣化，而臨床癥狀及肺部影像學表現不典型、痰涂片抗酸染色陰性的肺結核常易與普通細菌性肺炎、肺惡性腫瘤等疾病相互混淆，導致肺結核誤診、漏診、誤治率增加，嚴重影響患者預后[3]。

表1 患者1 2020-05-12胸腔積液mNGS結果及2020-05-19外周血mNGS結果Table 1 Results of mNGS in pleural effusion on 2020-05-12 and mNGS in peripheral blood on 2020-05-19 of patient 1

圖2 患者2胸部CT檢查結果Figure 2 Results of chest CT examination in patient 2

表2 患者2 2019-12-20肺泡灌洗液mNGS結果Table 2 Results of mNGS in bronchoalveolar lavage fluid of patient 2

圖3 患者2膿腫分枝桿菌基因組覆蓋圖Figure 3 Genome coverage map of mycobacterium abscess in patient 2

結核性胸腔積液（tuberculous pleural effusion，TPE）是結核最常見的肺外表現，由結核分枝桿菌直接侵犯胸膜或者體內結核病灶復發間接導致，部分患者胸部影像學并沒有發現明顯的結核病灶[8]。據統計，我國住院胸腔積液患者中約40%為TPE；雖然實驗室診斷技術的發展使TPE的診斷率提高，但仍有約20%的TPE患者無法明確病因[9]。結合本文患者1的臨床癥狀、影像學檢查、胸腔積液常規生化檢查、ADA以及結核感染特異性T細胞檢測結果，考慮結核性胸膜炎可能性大，然而其常規病原學檢測均陰性，診斷不明；胸膜活檢病理學檢查對TPE診斷至關重要[10]，但是患者為91歲的高齡，基礎狀況差，有內科胸腔鏡及支氣管鏡檢查相對禁忌證，難以進一步明確病因，導致其臨床診療再次陷入困境。征得家屬同意后留取胸腔積液外送北京金匙基因科技有限公司進行mNGS，結果示未檢出病原微生物；由于臨床高度懷疑結核性胸膜炎，再次送檢外周血進行mNGS，結果示檢出MTBC及堪薩斯分枝桿菌，最終確診為結核分枝桿菌及NTM混合感染。

基于二代測序技術的mNGS不依賴傳統微生物培養，不需要特異性引物，單次運行即可測定樣本中所有DNA/RNA基因組信息，實現所有病原菌的鑒定及分型，在臨床常規檢查反復陰性的復雜性、混合性感染性疾病的診治中表現出巨大優勢，近年來，mNGS在結核病診斷中的應用越來越多。2019年，ZHOU等[4]進行的一項評估mNGS在臨床標本中直接檢測MTBC診斷性能的前瞻性研究對105例臨床懷疑活動性結核病患者的痰、腦脊液、膿液等直接臨床標本進行培養，并進行X-pert檢測和mNGS，其中有45例患者臨床確診為活動性結核?。?3例肺結核和32例肺外結核?。?；mNGS診斷活動性結核病的靈敏度為44%、特異度為98%，與X-pert檢測的靈敏度（42%）相似，遠高于常規涂片培養方法（29%）；表明二代測序技術能夠快速檢測多種標本中MTBC，靈敏度及特異度較高，可用于活動性結核病的早期輔助診斷。黃暢宇等[1]報道了利用二代基因測序技術診斷的1例復雜性肺結核患者。上述研究表明，mNGS在肺結核早期診斷中具有較大的價值。mNGS的另一大優勢在于混合感染病原菌的鑒定，據報道，有10%～20%的結核病患者為混合感染[11]，同時其優越的分辨率能夠區分復發和再感染[12]。本文患者1即利用mNGS確診為結核分枝桿菌及NTM混合感染。結核分枝桿菌的耐藥性是目前全球結核病防控的嚴峻挑戰，也是亟待解決的難題，因而監測和了解結核分枝桿菌耐藥性的發展、演變、生物學和流行病學特點相當重要，而mNGS能夠快速篩選與結核病發展相關的多個耐藥靶基因[13-14]，從而構建多重耐藥結核和廣泛耐藥結核的個體化藥物治療方案[15-16]。相信未來mNGS必將在結核病診斷、治療、傳播鏈追蹤和持續耐藥性監測等方面發揮巨大潛力，為結核病的診療和控制做出杰出貢獻。

近年來，NTM肺病發病率呈快速增加趨勢，尤其是在結核病疫情較低的發達國家，NTM的分離率已超過了MTBC[17]。NTM是指除MTBC和麻風分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌的總稱，細菌學特點及抗原成分與結核分枝桿菌類似。據統計，目前共發現190多個NTM物種及亞種，致病的NTM中，鳥分枝桿菌復合群菌株以30.0%居于首位，其次是膿腫分枝桿菌（17.5%）和偶然分枝桿菌（13.0%），而我國較常見的為戈爾登分枝桿菌及膿腫分枝桿菌感染[18]。NTM可侵犯肺、淋巴結、皮膚和軟組織等，以肺部感染多見，臨床癥狀可表現為咳嗽、咳痰、咯血、低熱、乏力、盜汗、消瘦等，多為慢性病程，亦可表現為急性病程[19]。結核病及NTM肺病患者臨床癥狀及肺部影像學表現均類似，痰抗酸染色均可呈陽性，若未進一步菌種鑒定，易長期誤診為結核分枝桿菌感染[20]。本文患者2臨床癥狀及肺部影像學表現無特異性，第2次支氣管肺泡灌洗液檢測出抗酸桿菌，遂誤診為肺結核，后來肺泡灌洗液mNGS檢出膿腫分枝桿菌，最終確診為NTM肺病。NTM肺病的診斷需結合呼吸系統以及全身臨床癥狀、肺部影像學表現以及NTM分離培養；其中NTM分離培養是確診NTM肺病以及區別肺結核的關鍵，常用方法包括傳統液體和固體培養基培養、高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）、吖啶酯標記的DNA探針測定法、聚合酶鏈式反應（polymerase chain Reaction，PCR）或多重PCR法、PCR-限制性片段長度多態性分析法（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、DNA測序技術、反向雜交DNA擴增技術等[20-22]。mNGS在NTM鑒定中也表現出了相當的優勢及潛力。FEDRIZZI等[23]利用二代測序技術對NTM的47個類型菌株進行了測序，其中快生型分枝桿菌11株、慢生型分枝桿菌36株，同時，重構和分析了41個以前未被描述的NTM物種的基因組，拓展了對NTM的認識。黃暢宇等[1]報道了湖南省人民醫院2017年收治的1例常規抗結核治療效果欠佳的患者利用mNGS確診為NTM肺病，予以抗NTM治療10 d后患者臨床癥狀明顯好轉，復查CT示肺部病灶較前吸收。上述文獻表明，mNGS在NTM肺病菌種鑒定、基因分型、流行病學調查以及臨床診療、改善患者預后等方面發揮了巨大的作用。

結核病及NTM肺病是全球重要的公共衛生問題，臨床工作中要進一步提高診斷準確率，減少誤診及漏診。對高度懷疑結核分枝桿菌感染者，應充分結合常規抗酸染色鏡檢、結核桿菌培養以及分子生物學技術明確，早診斷、早治療，改善患者預后。對于呼吸道標本抗酸染色陽性者，不可忽略NTM感染的可能，尤其對那些抗結核治療效果差且持續痰涂片或痰培養抗酸桿菌陽性者，需要高度警惕NTM感染，應進一步完善菌種分型鑒定予以明確，以免延誤診斷及治療。mNGS作為一種新型病原學診斷技術，隨著臨床病例報道及病例對照研究的逐漸增多，在感染性疾病致病病原體鑒定中表現出了巨大的潛力及優勢，可以作為臨床常規檢測反復陰性、經驗性治療效果差的疑難復雜性疾病的一種重要補充診斷手段。

作者貢獻：馬瀟梟進行文章的構思與設計，撰寫論文，對文章整體負責、監督管理；高寶安進行文章的可行性分析，負責文章的質量控制及審校；馬瀟梟、牟干、劉玲進行文獻/資料收集與整理；牟干、劉玲進行論文的修訂、英文的修訂。

本文無利益沖突。

本文局限性：

首先，本文患者1因確診后轉往傳染病醫院進一步治療，后續病例追蹤中斷。其次，本文報道患者的臨床標本均外送北京金匙基因科技有限公司行mNGS，而非本院實驗室檢測。上述不足可能使本文結果存在一定偏倚。