欽州灣海水和香港牡蠣體內脂溶性貝類毒素污染特征*

徐軼肖 韋光領 王 玉 賈 櫻 高 寒 張 騰 佟蒙蒙

(1. 南寧師范大學 北部灣環境演變與資源利用教育部重點實驗室 南寧 530001; 2. 南寧師范大學 廣西地表過程與智能模擬重點實驗室 南寧 530001; 3. 浙江大學海洋學院 舟山 316000)

脂溶性貝類毒素(lipophilic shellfish toxins, LSTs)指在貝類脂肪組織富集而不易排出體外、具有熱穩定性、易溶解于有機溶劑的一大類毒素。根據化學結構特征, 脂溶性貝類毒素主要包括 6 類: 原多甲藻酸(azaspiracids, AZAs, 也叫氮雜螺環酸)、短裸甲藻毒素(brevetoxins, BTXs 或 PbTx)、環亞胺(cyclic imines,CIs)、大田軟海綿酸(okadaic acids, OAs)、蛤毒素(pectenotoxins, PTXs, 也叫扇貝毒素)和蝦夷扇貝毒素(yessotoxins, YTXs)。這些貝類毒素由海洋藻類產生, 經貝類濾食攝入累積代謝而成。貝類沾染 LSTs毒素是沿海國家常見的水產品安全問題(紀瑩等,2018; Farabegoli et al, 2018)。目前我國貝類主要沾染AZAs、CIs、OAs、PTXs、YTXs 五大類組分, 除 YTXs主要發生在北方海域, 其他組分從南到北均有發生(李美慧等, 2016; 梁玉波等, 2019)。

廣西北部灣位于我國南海西北部, 與飽受海洋環境問題困擾的我國東部海域相比, 長期被譽為“潔海、凈海” (鐘春云, 2015)。事實上, 2010 年以來, 廣西北部灣海域環境日益惡化, 藻華頻發(Xu et al,2019), 但對該海域的有毒藻及有毒貝類研究仍遠遠不夠。北部灣脂溶性貝類毒素研究早期見吳施衛等(2005)、楊美蘭等(2009)、黃玉柳等(2010)和黃翔等(2013), 他們通過小白鼠生物法對腹瀉性貝毒(可能包含脂溶性貝類毒素中的 OAs、DTXs、PTXs 組分)進行了研究, 近年學者們為了明確毒素組成和含量大小, 應用液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)開展脂溶性貝類毒素研究(劉仁沿等, 2008, 2014; 紀瑩等,2018; 戴梓茹等, 2018)。在這些為數不多的北部灣LSTs 毒素工作中, 環亞胺毒素中的GYM (gymnodimine)在我國首次被報道恰恰來自廣西北海的緣齒牡蠣(Dendostrea crenulifrea) (劉仁沿等, 2008), 2016 年春季中國沿海31 種養殖貝類中, 廣西北海貝類的GYM均值最高, 其中對角蛤(Antigono lamellaris) GYM 含量高達211.47 μg/kg (紀瑩等, 2018)。國際上至今未規定 GYM 限量標準, 如此高含量的 GYM 對人類的健康影響仍無法評估。

北部灣脂溶性貝類毒素研究多集中在廣西北海(劉仁沿等, 2008, 2014; 紀瑩等, 2018), 其他海域研究很少。欽州灣位于廣西北部灣北部, 過去三十年溶解態無機氮(DIN)、磷酸鹽(PO4)均經歷了顯著增長(Xu et al, 2019), 部分區域出現富營養化, 海域環境利于海洋生物生長(楊斌等, 2014), 是國內外聞名的牡蠣養殖基地(伍晉宏等, 2016)。香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis), 又稱香港巨牡蠣, 俗稱“大蠔”、“白蠔”, 是欽州灣主要養殖品種、欽州四大名貴海產之一(賈真等, 2019)。目前仍不了解該海域香港牡蠣沾染LSTs 毒素情況與食用安全性。此外, 北部灣包括欽州灣至今未有海水脂溶性貝類毒素污染研究, 而這是了解本地區LSTs 毒素來源與食物鏈富集的關鍵因素。

固相吸附毒素跟蹤技術(solid phase adsorption toxin tracking, SPATT)通過大孔樹脂對特定貝類毒素快速高效的吸附性, 吸附濃縮海水中的貝類毒素(MacKenzie et al, 2004; Roué et al, 2018)。該項技術已被廣泛應用到國內外不同海域進行LSTs 毒素預警預測研究(Rundberget et al, 2009; 渠佩佩等, 2016)。因此, 本文選擇欽州灣為樣品采集地點, 以香港牡蠣為研究對象, 通過SPATT 和LC-MS/MS 方法, 對欽州灣海域養殖區水體和香港牡蠣體內的貝類毒素進行連續一年的污染分析, 結果可為欽州灣和北部灣脂溶性貝類毒素研究、牡蠣食用安全和出口貿易管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

本文研究的脂溶性貝類毒素氮雜螺環酸類AZA1、AZA2、AZA3, 鰭藻毒素 DTX1、DTX2, 環亞胺毒素GYM、大田軟海綿酸OA、扇貝毒素PTX1、PTX2, 螺環內酯毒素SPX1, 蝦夷扇貝毒素YTX 標準品購自加拿大海洋生物科學研究所(The National Research Council Canada, Marine Analytical Chemistry Standards Program,Halifax NS, Canada)。毒素提取所需的分析純級甲醇購自中國國藥集團化學試劑有限公司, HPLC-MS/MS分析所需的色譜純級甲醇和乙腈購自美國的 Fisher公司。

1.2 SPATT 吸附裝置制作

SPATT 盤具體制作參考渠佩佩等(2016), 即將干重 9.00 g±0.05 g 的 Diaion?HP-20 樹脂(H&E Co., Ltd,China)放在 23 cm×12 cm 的 120 μm 孔徑篩絹(SEFAR NITEX 03-120/49)中, 繡花繃子(直徑9 cm)固定。使用前活化: 100%甲醇中浸泡48 h, 取出, 用大量MilliQ 超純水反復沖洗, 然后MilliQ 水中超聲10 min, 取出后用MilliQ 水沖洗三遍后, 浸泡其中4—6oC 冷藏待用。

1.3 樣品采集

2015 年 10 月至 2016 年 9 月在欽州灣養殖區海水交換口設置采樣點S1、S2 和S3 (圖1)。在距水面2m 處將已經活化的SPATT 盤用漁線系在香港牡蠣養殖鏈上, 同一位置兩個重復(n=2), 采樣時取出SPATT 樹脂盤放入密封袋內, 同一位置放入新的SPATT 吸附裝置, 并采集該采樣點的香港牡蠣樣品,三個重復(n=3), -20°C 冷凍保存待后續分析。研究中每月采樣一次, 若海況欠佳不利作業, 采樣時間相應提前或滯后＜5 天, 共采集 51 份 SPATT; 2015 年 11 月損失一個貝類樣品, 共采集35 份香港牡蠣樣品。

1.4 樣品分析

1.4.1 SPATT 毒素提取 將SPATT 盤置于燒杯中,用500 mL MilliQ 水浸泡5 min, 輕甩去水分并除去多余的鹽分, 重復一次。將樹脂轉移至30 mL 玻璃注射針筒中, 加入 30 mL 甲醇, 用玻璃棒輕輕攪動樹脂,使之充分浸泡于甲醇中。1 min 后打開塞閥, 調節流速, 以 1 mL/min 過 0.22 μm 濾膜收集在血清瓶中。氮吹濃縮, 用 100%甲醇定容到 5 mL, 渦旋 1 min。取1 mL 過 0.22 μm 有機相濾膜裝進色譜進樣小瓶中,-80oC 冷凍保存, 待 LC-MS/MS 分析。

圖1 采樣點Fig.1 Sampling sites

1.4.2 香港牡蠣毒素提取 牡蠣樣品解凍去殼攪成勻漿, 準確稱取2.00 g±0.02 g 并加入9 mL 100%甲醇, 渦旋混勻 1 min, 離心(4000×g, 10 min), 取上清液轉移至30 mL 玻璃針筒中。殘渣再用9mL 甲醇重復提取 1 次, 合并上清液過 0.22 μm 針式過濾器, 收集樣品至血清瓶中, 氮吹濃縮, 用甲醇定容到 5 mL,-80oC 冷凍保存, 待 LC-MS/MS 分析。由于 OA/DTXs類毒素易發生轉化, 為了評估 OA 類毒素食用安全,需對貝肉水解后測定毒素總量(OA、DTX1、DTX2):取 1 mL 上述提取液于進樣小瓶中, 加入 125 μL 2.5 mol/L NaOH, 渦旋 0.5 min 后 76oC 加熱 40 min, 待流水冷卻至室溫后用 125 μL 2.5 mol/L HCl 中和, 過0.22 μm 濾膜后, 于-80oC 保存, 待 LC-MS/MS 分析。

1.4.3 LC-MS/MS 分析 采用四級桿-線性阱復合型液相色譜質譜聯用儀(5500 QTRAP LC-MS/MS system, AB Sciex Instruments, Foster City, CA, USA)對貝類毒素進行定性和定量檢測。HPLC 條件:Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm), 柱溫 40oC, 流速 0.350 mL/min, 進樣體積5 μL。流動相 A 為含 50 mmol/L 甲酸、2 mmol/L 甲酸銨的水, 流動相B 為含50 mmol/L 甲酸、2 mmol/L甲酸銨的 95%乙腈水溶液。梯度洗脫: 0—0.01 min,80% A; 0.01—7.0 min, 由80% A 線性梯度至10% A;7.0—10.0 min, 10% A; 10.0—10.10 min, 回到 80% A;10.10—12.0 min, 80% A。質譜條件見王玉(2018)。

1.5 數據分析

采用外標法進行毒素定量, 用對應標準回歸方程進行含量計算。對于沒有標準品的毒素, 參照王玉(王玉, 2018)進行去簇電壓和碰撞能量設定, 通過對比定性離子對的質荷比確定。OA、DTX-1、DTX-2 毒素含量根據毒素當量因子 1.0、1.0、0.6 (Alexander et al,2009)換算成μg/kg OA 當量, 以評估OA 類毒素食用安全。計算結果扣除空白值, 保留二位有效數字。

2 結果

2.1 毒素種類及含量

在監測的14 種脂溶性貝類毒素AZA1、AZA2、AZA3、DTX1、DTX2、GYM、OA、PTX1、PTX2、SPX1、YTX、Homo-YTX、45-OH-YTX、45-OH-homo YTX 中, GYM 在SPATT 吸附裝置和香港牡蠣中都有檢出, OA 和 PTX2 僅在 SPATT 檢出, DTX2、SPX1 和Homo-YTX 僅在香港牡蠣檢出(表1)。SPATT 分析的毒素最高值為 OA: 143.94 μg/(kg resin·30d), 香港牡蠣分析的最高值為GYM: 52.14 μg/kg (表1)。海水和香港牡蠣中檢出率最高的成分分別為 OA (98.0%)和GYM (100%)。

2.2 海水毒素變化

以 SPATT 樹脂盤吸附的脂溶性貝類毒素表征海水中相應的毒素, 三個監控點毒素GYM、OA、PTX2標準差分別為 0—0.4 4、 1.5 4—3 9.6 3、0.14—4.36 μg/(kg resin·30d), 變化幅度較大, 故用毒素含量平均值進行比較分析, 發現在整個監控期內,海水中共檢出GYM、OA、PTX2 三種毒素, 其中OA的含量最高, PTX2 其次, GYM 的含量最低(圖2)。以3—5 月為春季、6—8 月為夏季、9—11 月為秋季、12月至次年2 月為冬季, 發現海水中OA 和PTX2 的均值夏季高, 其他季節低。其中 OA 在 7 月最高, 為53.09 μg/(kg resin·30d), 次均值 31.04 μg/(kg resin·30d)在 6 月; PTX2 均值在 6 月最高, 為 6.68 μg/(kg resin·30d), 次均值 4.17 μg/(kg resin·30d)在 8 月(圖 2)。海水GYM 在冬季的2 月最高, 但全年含量變化不明顯, 為 ND—1.26 μg/(kg resin·30d) (圖 2)。

表1 欽州灣海水和香港牡蠣脂溶性貝類毒素種類及含量Tab.1 Toxin profiles and contents in seawater and Crassostrea hongkongensis in the Qinzhou Bay

圖2 SPATT/海水中脂溶性貝類毒素季節變化特征Fig.2 Temporal variation of lipophilic shellfish toxins in SPATT resins/seawaters

2.3 香港牡蠣體內毒素變化

香港牡蠣體內共檢出 GYM、DTX2、SPX1、Homo-YTX 四種毒素, Homo-YTX 被檢出但未能定量。GYM、DTX2、SPX1 標準差分別為1.95—14.33、0.06—0.95、0—1.20 μg/kg, 變化幅度較大, 仍用毒素含量平均值進行比較分析, 具體見圖 3, 發現 GYM的含量最高, DTX2 和SPX1 次之。季節變化上, GYM冬季和夏季較高, 均值最高值和次高值分別為2 月和8 月的 43.19 和 38.22 μg/kg; DTX2 在春季和夏季較高,均值最高值和次高值分別為 3 月和 7 月的 7.55 和2.31 μg/kg。SPX1 冬季較高, 但含量全年變化小, 為ND—1.98 μg/kg。

2.4 海水與香港牡蠣毒素相關性

因海水(SPATT)與香港牡蠣體內均檢出 GYM,且檢出率分別為58.8%和100%, 故選擇GYM 分析海水與香港牡蠣體內毒素的相關性。發現海水和香港牡蠣體內GYM 毒素均值變化趨勢基本一致, 呈正相關(圖 4), Pearson 相關系數為 0.70 (P=0.017, P＜0.05)。兩者的GYM 含量10 月至次年1 月趨勢有所不同, 但從 1 月份開始兩者均急劇增長, 在 2 月份達到峰值,隨后緩慢減少, 在夏季再次增加, 并在 8 月份達到第二個峰值(圖 4)。總的來說, 除了2 月出現短暫峰值,海水和香港牡蠣的GYM 含量春夏季高、秋冬季低。

將檢測到的 OA 和 DTXs 毒素換算成 OA 當量,對海水(SPATT)和香港牡蠣中的OAs 毒素含量進行比較, 發現兩者亦呈現相近的變化趨勢(圖 5), 但相關性較弱, Pearson 相關系數為0.35, 分析與牡蠣體內很長時間 OA 類毒素含量低/未檢出有關。海水毒素含量峰值出現時間比香港牡蠣中提前: 前者2 月出現短暫的峰值后緩慢減少, 5 月開始急劇增長, 并在7 月達到峰值, 但后者直至3 月才出現短暫的峰值, 隨后維持在較低水平, 并從 6 月開始增長, 7 月達到次峰值(圖 5)。

圖5 OA 當量在海水和香港牡蠣中的分布特征Fig.5 OA equivalents relationships between SPATT discs and Crassostrea hongkongensis tissues

3 討論

3.1 海水毒素含量比較

SPATT 技術通過聚合樹脂被動吸附海水中由產毒藻釋放的生物毒素, 以期實現生物毒素實時監控和提前預警(張亞亞等, 2020)。該技術最早見于新西蘭脂溶性貝類毒素監測中(MacKenzie et al, 2004), 后在實驗室及野外的脂溶性和水溶性貝類毒素研究中得到廣泛應用, 它與傳統的有毒藻細胞、貝毒和魚毒檢測相比, 具有可靠、靈敏及同時監測多類毒素的優點(Roué et al, 2018)。至今研究者們使用了二十來種樹脂開展 SPATT 研究, 其中, DIAION?HP20 樹脂被證實為最常用有效的類型, 在海水脂溶性貝類毒素中得到了大量成功應用(宿志偉 等, 2016; 渠佩佩等,2016; Roué et al, 2018)。

本文系首次對中國北部灣海水LSTs 含量進行研究, 本研究應用 SPATT 技術發現欽州灣海水中存在GYM、OA、PTX2 三種毒素, 未發現黃、東海海域常見的DTX1 和YTX(李兆新等, 2016; 宿志偉等, 2016;渠佩佩等, 2016; Li et al, 2017)。其中, OA 和 PTX2 在我國海域分布廣泛(渠佩佩等, 2016; 宿志偉等, 2017;Li et al, 2017; Chen et al, 2018), 而GYM 目前僅在局部海域檢出(渠佩佩等, 2016; 宋新成等, 2017; 宿志偉等, 2017)。欽州灣海水脂溶性貝類毒素含量較國內其他海域低, 如黃海桑溝灣GYM、OA、PTX2 三種毒素最高值達 37.44、25.48、65.44 μg/(20g resin·7d)(宿志偉等, 2017), 單位換算成 μg/(kg resin·30d)后約為欽州灣海水對應毒素最高值的224.0、2.1、57.7 倍, 欽州灣海水與浙江南麂相對比較接近, 前者GYM、OA、PTX2 最大值分別是后者最大值的1.8、6.2 和0.16 倍(渠佩佩等, 2016; 表 1)。可見, 我國各個海域海水LSTs 毒素組成和含量大小存在差別, 這與各自海域海水的產毒藻組成和豐度、理化特征、沉積環境等密切相關(Wang et al, 2015; 梁玉波等, 2019)。

3.2 牡蠣毒素含量與安全評估

本文系首次對欽州灣養殖的香港牡蠣LSTs 含量進行研究。早在 2002 年, 廣西沿岸已發現貝類沾染腹瀉性貝毒(可能OAs、PTXs)(吳施衛等, 2005), 但當時檢測采用的是生物小白鼠法, 故無法得知結果是否可靠(假陽性)、及確切的染毒成分和毒性大小。在最近采用的液-質聯用法研究中, 欽州灣櫛江珧(Atrina pectinata)未檢測到 LSTs 毒素(戴梓茹等,2018), 但本文在該海域香港牡蠣體內檢測到了四種常見的 LSTs 成分(DTX2、GYM、SPX1、Homo-YTX),結果很可能與兩者分析的貝類品種不同有關。本文的香港牡蠣GYM 和SPX1 平均含量與2008 年國內首次報道的廣西北海緣齒牡蠣體內的GYM 含量12.00μg/kg(劉仁沿等, 2008)接近, 但比2016 年春季廣西北海對角蛤(A. lamellaris)、櫛江珧(A. pectinata)、牡蠣(Crassostrea sp.)、厚殼貽貝(Mytilus coruscus)、短文蛤(Meretrix petechialis)、文蛤(Meretrix linnaeus)貝類體內的 GYM 含量 49.75 μg/kg (2.47—211.47 μg/kg)和 SPX1 含量1.11 μg/kg (ND—2.35 μg/kg)(紀瑩等, 2018)低。毒素檢出率則與紀瑩等(2018)接近, GYM 均為100%,SPX1 分別為85.7%和83.3%, 上述差異很可能與貝類種類和采樣時間不同有關。至于本文頻繁檢出的DTX2 未被檢測(紀瑩等, 2018), 所以無法進行比較。

與國內其他海域貝類 LSTs 含量相比, 總的來說廣西沿岸貝類 LSTs 毒素成分較少, 如常檢測不到OA、PTX2、YTXs 等, 毒素含量亦偏低, 但 GYM 例外, 其含量和檢出率明顯大于國內其他海域來源的貝類(陳建華等, 2014; 紀瑩等, 2018; 陳雨等, 2018;Liu et al, 2019)。目前我國尚未對貝類LSTs 毒素制訂相應的國家標準, 食用安全評估往往參考歐盟標準,AZA、OA、PTX 為 160 μg/kg, YTX 為 1.0 mg/kg [EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM),2010], 環亞胺類毒素GYM 和SPX1 等成分國際上仍未設定標準, 有時參考腹瀉性貝類毒素的標準160 μg/kg 進行評價(紀瑩等, 2018), 參照上述標準,本文采集的欽州灣香港牡蠣盡管受到多個LSTs 毒素組分污染, 但未超過食用安全標準, 可放心食用。

3.3 毒素季節變化特征

海水和貝類中的脂溶性貝類毒素普遍存在季節變化特征。本文欽州灣海水和香港牡蠣體內的 LSTs毒素通常夏季和冬季含量高, 尤其是夏季, 多個毒素成分達到峰值, 且海水和貝類相比, 達到峰值的時間同步或提前。我國黃海海區研究發現膠州灣(李兆新等, 2011)、靈山灣(張婷婷, 2015)、桑溝灣(宿志偉等,2016)海水中, LSTs 毒素成分如PTX2、OA、DTX1、GYM、PTX2 也在夏季7—8 月達到峰值, 東海南麂的LSTs 毒素夏季含量最高, 其次是春秋季(渠佩佩等,2016)。本文毒素峰值變化趨勢與這些研究類似, 分析可能因為夏季水溫高, 利于水體中 LSTs 產毒藻生長從而釋放更多毒素至水體中, 高產毒藻密度也利于貝類攝食有毒藻并積累毒素。但其他研究則發現海水中 OA 濃度 5 月最高(宋新成等, 2017), 貝類 OA 和PTX2 傾向于春季和冬季, GYM 則于冬季達到峰值(Wu et al, 2015), 貝類 OA 秋季、PTXs 春季最高,AZAs、GYM 和YTXs 則無季節性差異, 具體隨品種而異(陳雨等, 2018), 最近更有學者提出貝類毒素季節變化呈地點特異性(site-specific seasonal variation pattern)(Liu et al, 2019)。因此, 關于欽州灣/北部灣貝類脂溶性毒素季節變化特征, 有必要進一步擴大采樣范圍, 并將更多的貝類品種納入研究。

3.4 LSTs 潛在產毒藻

海水和貝類體內的 LSTs 毒素來源于海洋微藻,我國北部灣之外海域已記錄多種 LSTs 潛在產毒藻(Gu et al, 2013; Jiang et al, 2014; Liu et al, 2017; 勾玉曉等, 2018), 但廣西北部灣 LSTs 產毒藻研究極為匱乏, 本文亦未能就海水樣品中的 LSTs 肇事藻開展識別工作。目前, 僅劉仁沿等(2016)指出廣西北海分布有網狀原角藻和具刺膝溝藻孢囊, Gu 等(2013)在防城港海域分離到部分腹孔環胺藻株能產生 AZA2 毒素(Gu et al, 2013; Li et al, 2016)。而對廣西沿岸反復檢測到、濃度多次達到全國最高, 潛在危害突出的GYM 產毒藻尚未分離發現。GYM 是一種螺旋形環亞胺結構, 最先從新西蘭牡蠣(Tiostrea chilensis)中分離到, 產毒藻為甲藻門(Dinophyta)、凱倫藻屬(Karenia)下的鞍狀凱倫藻(K. selliformis)和亞歷山大藻屬(Alexandrium)下的奧氏亞歷山大藻(A. ostenfeldii)(與A. peruvianum 同種異名) (Farabegoli et al, 2018)。目前, 中國其他沿海包括北部灣仍未分離明確能產GYM 毒素的微藻, 只在我國渤海灣發現了不產毒的奧氏亞歷山大藻(Gu, 2011)、香港海域發現對輪蟲具有急性毒性的鞍狀凱倫藻(李思等, 2018)。由于自然水體中 LSTs 肇事藻濃度往往不高, 通過傳統實驗手段不易分離發現目標藻, 接下來有必要借助在浮游植物檢測研究中得到廣泛應用的實時熒光定量PCR(qPCR)技術(Medlin et al, 2017), 完成北部灣LSTs 目標藻定量定性分析。

4 結論

(1) 海水共檢出 GYM、OA 和 PTX2 三種組分, 平均濃度分別為 0.44、14.20 和 1.67 μg/(kg resin·30d)。香港牡蠣共檢出 DTX2、GYM、SPX1、Homo-YTX四種組分, 其中 Homo-YTX 為定性結果, DTX2、GYM、SPX1 三者平均濃度分別為 0.95、18.86 和0.95 μg/kg。

(2) GYM 毒素均值在海水和香港牡蠣之間變化趨勢呈正相關, Pearson 相關系數為0.70; OAs 毒素則變化趨勢類似, 但Pearson 相關系數0.35。

(3) 毒素含量存在一定季節變化。海水 OA 和PTX2 夏季高, 其他季節低, 均值最高值分別發生在7月和 6 月; 香港牡蠣體內 GYM 冬季和夏季較高,DTX2 春季和夏季較高; 海水中的 GYM 和香港牡蠣體內的SPX1 全年季節變化均不明顯。

因此, 欽州灣海水和香港牡蠣已受到多個 LSTs毒素組分污染, 海水 LSTs 毒素含量較國內其它海域低, 參考歐盟 LSTs 毒素標準, 欽州灣香港牡蠣脂溶性貝類毒素未超標, 可放心食用 。