基于DPPH-HPLC的食涼茶抗氧化組分的快速篩選及分析

許平翠 張曉芹 陳禮平 王娜妮*

(1. 浙江省中醫藥研究院，杭州 310007；2. 麗水市中醫院，麗水 323000)

食涼茶是畬族常用藥材，為臘梅科植物柳葉蠟梅Chimonanthus salicifolius S. Y. Hu和浙江臘梅Chimonanthus Zhejiangensis M. C. Liu的干燥葉[1]。據《浙江省中藥炮制規范》2015年版收載，食涼茶具有清熱解毒、健脾益氣等功效[2，3]。現代研究表明，食涼茶中主要含有揮發油、香豆素、黃酮、以及生物堿等有效活性成分[4]。研究表明，食涼茶具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[5]。DPPH自由基在517nm有強吸收，與自由基清除劑反應可使吸收減弱或消失[6，7]，已有研究將DPPH-HPLC法用于篩選中藥抗氧化活性成分[8，9]，目前尚無關于DPPH-HPLC法快速篩選食涼茶抗氧化活性的報道。

1 儀器與材料

SHZMADZULC-20AT高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(PDA)；KQ-400DE型數控超聲波清洗器；HC-2518高速離心機；AE-50電子天平；多功能粉碎機；MAX190酶標儀；XMTD-8222恒溫水浴鍋。對照品：槲皮素(批號MUST-14082610)，東莨菪內脂(批號BWB50099)，山奈酚(批號BWB50802)均購于北京世紀奧科生物技術有限公司；DPPH(≥97%，批號RQ18R305)購于上海瑞永生物科技有限公司；抗壞血酸(VC，批號20130413)購于廣東光華科技股份有限公司；娃哈哈純凈水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。食涼茶經副任中藥師林娜鑒定，為臘梅科植物柳葉蠟梅Chimonanthus salicifolius S. Y. Hu的干燥葉。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

稱取食涼茶粉末約5.0g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加10倍水，回流提取2次，每次1h，合并濾液，濃縮并定容至50mL，用微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

取東莨菪堿、蘆丁、東莨菪內酯、濱蒿內酯、槲皮素、山柰酚對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成1mL含東莨菪堿0.025mg、蘆丁0.010mg、東莨菪內酯0.0290mg、濱蒿內酯0.0120mg、槲皮素0.010mg、山柰酚0.010mg的混合溶液，備用。

2.3 色譜條件

EclipseXDB-C18色譜柱( 250mm×4.6mm，5μm) ，流動相為乙腈( A) -0. 1%甲酸水( B) ，梯度洗脫：0～10min，90%B；10～15min，90%-85%B；15～30min，85%-80%B；30～50min，80%-50%B；50～55min，50%B，流速為1.0mL/min，柱溫30℃，波長254nm，進樣量10μL。

2.4 食涼茶提取物的DPPH自由基清除率測定

將2mL供試品溶液加入到2mL的80μg/mL DPPH甲醇溶液中，室溫避光孵育30min，在517 nm波長下，測其吸光度As，同時測定2mL甲醇與2mL的DPPH溶液孵育后的吸光度Ac，以及2mL供試品溶液與2mL的甲醇孵育后的吸光度Ab，按公式計算DPPH清除率。DPPH清除率(%)=[1-(As-Ab)/Ac]×100

2.5 DPPH-HPLC篩選條件優化

DPPH-HPLC篩選方法受到反應時間、DPPH濃度、食涼茶提取物和DPPH體積比等多種因素影響，為保證篩選結果的準確度和準確性，對關鍵影響因素進行優化，80μg/mL VC溶液作為對照，結果見圖1。由圖可知，食涼茶提取物和80μg/mL DPPH甲醇溶液等體積避光反應30min，DPPH清除率較高。

圖1 DPPH-HPLC篩選條件優化

2.6 DPPH-HPLC用于抗氧化活性物質的快速篩選

按“2.4”方法制備供試品樣品和對照樣品，13000r/min，離心10min，取上清液，微孔濾膜過濾，進行高效液相色譜分析，比較各個成分峰面積的改變，以峰強度減少大于80%的成分被認定為潛在的抗氧化活性物質。結合對照品，結果見圖2。東莨菪堿、蘆丁、濱蒿內酯峰強度稍有減小，而東莨菪內酯峰強度顯著減小，槲皮素、山奈酚消失，推測其DPPH自由基清除活性較強。

圖2 食涼茶提取液DPPH-HPLC色譜圖和峰強度對比圖1.東莨菪堿；2.蘆丁；3.東莨菪內酯；4.濱蒿內酯；5.槲皮素；6.山奈酚

2.7 抗氧化活性成分分析

2.7.1抗氧化活性成分含量測定

將混合對照品溶液配置成系列濃度的混合對照品溶液進行HPLC分析，以各成分的峰面積(Y)對樣品濃度(X)繪制標準曲線，得線性回歸方程分別為東莨菪內酯Y=16074X-6155.2(r=0.9996)，槲皮素Y=39901X-13908(r=0.9999)，山奈酚Y=28558X-17224(r=0.9995)。取混合對照品溶液進行精密度考察，精密度的RSD分別小于2.0%，表明儀器精密度良好。精密稱取5.0食涼茶粉末，按“2.1”方法制備供試品溶液，進行穩定性、重復性、加樣回收率考察，得穩定性、重復性RSD分別小于2.0%，表明樣品穩定性及本方法重復性良好；加樣回收率分別為97.67%、86.61%、86.71%，RSD分別為0.34%、0.25%、0.53%。最后，測定食涼茶樣品，計算其含量分別為0.106mg/g、0.165mg/g、0.156mg/g。

2.7.2活性成分的抗氧化能力評價

將篩選出的抗氧化活性成分進行體外抗氧化活性評價。取東莨菪內酯、槲皮素、山奈酚、VC用甲醇配成系列濃度的對照品。按“2.4”方法計算DPPH清除率，并計算EC50值(清除50%DPPH時所需要的濃度)。結果見圖3。可以看出東莨菪內酯、槲皮素、山奈酚均有較強的DPPH自由基清除能力，可能是食涼茶發揮抗氧化作用的重要藥效物質。

圖3 東莨菪內酯、槲皮素、山奈酚、VC的DPPH自由基清除率與EC50結果

3 討論

食涼茶中槲皮素屬于黃酮醇類成分，具有抗氧化、抗菌等多種生物活性，山奈酚屬于黃酮類成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用，東莨菪內酯屬于香豆素類成分，具有較好的體外抗氧化活性。本實驗建立了DPPH-HPLC方法快速測定食涼茶中抗氧化活性成分并同時分析其抗氧化能力，避免了傳統分離制備及抗氧化實驗操作繁瑣、耗時的缺點，能夠快速、簡便、靈敏分析抗氧化活性成分。建立HPLC方法同時測定3種抗氧化活性成分，建立的方法簡便可行，準確度高、靈敏度號，為食涼茶抗氧化功能的質量評價提供實驗依據。