仙方活命飲對滑膜炎大鼠炎癥氧化應激水平及NLRP3/Caspase-1通路活性的影響

董樺，杜書浩，榮兵

天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津300193

滑膜炎是滑膜組織因急性創傷或慢性勞損等刺激導致的一種非感染性炎癥，臨床表現為關節局部疼痛、腫脹，活動能力受限，嚴重影響患者的生活［1］。滑膜炎的發生與關節炎癥因子的表達密切相關，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素6（IL-6）作為促炎因子，能促使炎癥發生，加重患者關節功能障礙［2］。同時炎癥使體內氧化與抗氧化作用失衡，導致氧化應激的發生。Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體能夠調節半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，誘導細胞炎癥，是各種炎癥性疾病治療的靶點。在膝骨關節炎組織中，NLRP3、Caspase-1 mRNA 和蛋白表達顯著降低［3］。另外，阻斷NLRP3/Caspase-1 通路可下調Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白表達，減輕呼吸道炎癥［4］。仙方活命飲出自《校注婦人良方》，具有清熱解毒、消腫潰堅、活血止痛的功效，常用于膿皰瘡、癤腫、蜂窩組織炎、乳腺炎、化膿性扁桃體炎等屬熱毒實證者。研究顯示，仙方活命飲口服結合關節鏡下清理術可明顯縮短化膿性膝關節炎的治療療程［3］。但其對NLRP3/Caspase-1 通路及關節炎癥因子表達影響的研究未見報道。我們于2020年6月—2020年8月通過皮下注射脂多糖（LPS）法建立大鼠背部氣囊滑膜炎模型，觀察仙方活命飲對滑膜炎大鼠炎癥和氧化應激水平的影響，并探討其與NLRP3/Caspase-1 通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康SD 大鼠95 只，雄雄各半，體質量180～220 g，購自山東大學實驗動物中心。符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規定，按照3R 原則給予實驗動物人道的關懷照顧。飼養條件：溫度22 ℃，濕度55%，12 h/12 h 光暗循環。適應性飼養1周后用于實驗。

1.1.2 仙方活命飲藥液 藥材飲片來自天津中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。取白芷3 g、貝母6 g、防風6 g、當歸尾6 g、甘草節6 g、皂角刺（炒）6 g、穿山甲（炙）6 g、天花粉6 g、乳香6 g、沒藥6 g、金銀花9 g、陳皮9 g混合，常規方法煎煮，于恒溫水浴鍋中濃縮至含生藥2 g/mL。按照人和大鼠體表面積換算給藥劑量，則其低、中、高劑量分別對應生藥含量4.6、9.2、18.4 g/kg。將藥液置于-20 ℃保存，給藥前復溫。

1.1.3 試劑與儀器 吲哚美辛片（每片25 mg）購自臨汾奇林藥業有限公司，使用蒸餾水配置，現配現用。LPS 購自北京百奧萊博科技有限公司，使用無菌平衡鹽溶液配制成10 mg/mL 溶液，4 ℃保存備用。丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、TNF-α、IL-6 酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；蘇木精—伊紅（HE）染液購自北京四正柏生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）和β-actin鼠抗均購自美國Sigma 公司；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒均購自北京中山金橋生物科技有限公司；TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 鼠抗、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗均購自美國Abcam 公司；Fax-20100型酶標儀購自美國INStat 公司；尼康SMZ745 型光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；ChemiDoc-MP 全能型凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 滑膜炎動物模型制備 80 只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉，背部朝上固定于手術臺，用8%硫化鈉溶液脫去背部被毛備用。用鑷子挑起背部肩胛正中區皮膚，皮下注射20 mL 無菌空氣（0.22 μm 微孔濾膜過濾針筒內空氣）形成氣囊；第3 天再次注射10 mL 無菌空氣，以維持氣囊，第6 天注射10 mL 無菌空氣后，接著向氣囊中注射LPS 20 μg/kg，待背部氣囊皮膚出現紅腫且大鼠出現瘙癢不安、撓耳舔足癥狀，證明造模成功［6］。另取15只大鼠作為對照組，按上述方法制備氣囊，于實驗第6天向氣囊中注射等體積無菌平衡鹽溶液。

1.3 動物分組與干預 將造模成功的75 只大鼠使用隨機數字表法分為模型組、吲哚美辛組、低、中、高劑量仙方活命飲組，每組各15 只，另取15 只正常大鼠作為對照組。吲哚美辛組給予5 mg/kg 吲哚美辛10 mL/kg 灌胃，低、中、高劑量仙方活命飲組分別給予含生藥4.6、9.2、18.4 g/kg 的仙方活命飲藥液10 mL/kg 灌胃，對照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，于造模完成后，每天給藥1次，連續7 d。

1.4 標本采集 各組最后一次給藥24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉處死，股動脈取血，-80 ℃冰箱保存待用。將大鼠背部朝上固定于手術臺上，切開背部氣囊皮膚，用4 mL 無鈣鎂Hank"s 液灌洗氣囊，收集灌洗液，4 ℃冰箱保存待用。切取背部滑膜組織，每組取5 份滑膜組織放入4%多聚甲醛固定，用于HE 染色；其余滑膜組織放入凍存管中-80 ℃保存，用于Western blotting檢測。

1.5 氣囊滲出液量測算和灌洗液中白細胞數量檢測 收集氣囊灌洗液于10 mL 帶刻度的試管中，準確記錄灌洗液量，滲出液量=灌洗液量-4 mL。然后用移液器吸取0.02 mL 灌洗液，加入3%冰醋酸0.38 mL，生物顯微鏡下計數白細胞。

1.6 氣囊灌洗液中氧化應激指標MDA、CAT、SOD、GSH檢測 采用ELISA法。取氣囊灌洗液，3 000 r/min離心15 min（離心半徑15 cm），取上清。使用ELISA試劑盒檢測MDA、CAT、SOD、GSH含量，按照試劑盒說明書操作，使用酶標儀讀取吸光度值，依據標準曲線計算各自含量。

1.7 氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平檢測 采用ELISA 法。取股動脈血和氣囊灌洗液，以13 000 r/min 離心15 min，取上清。使用ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-6水平，按照試劑盒說明書操作。

1.8 滑膜組織病理檢查 采用HE 染色。取滑膜組織，加入梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機作約5 μm厚切片。HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 蛋白檢測 采用Western blotting 法。取滑膜組織，加入蛋白提取液提取總蛋白，使用BCA 試劑盒對蛋白進行定量。取蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉。分別加入一抗（稀釋比例為1∶2 000），4 ℃孵育過夜。加入含辣根過氧化物酶的二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育2 h。使用ECL顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統分析灰度值。以β-actin 為參照，計算目標蛋白的相對表達量。

1.10 統計學方法 采用SPSS24.0 統計軟件。計量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩間比較行SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組氣囊滲出液量和灌洗液中白細胞數量比較 見表1。

表1 各組氣囊滲出液量和白細胞數量比較（±s）

表1 各組氣囊滲出液量和白細胞數量比較（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與仙方活命飲低劑量組相比，cP＜0.05；與仙方活命飲中劑量組相比，dP＜0.05。

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2.2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH 含量比較 見表2。

2.3 各組氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平比較 見表3。

2.4 各組滑膜組織病理特征情況 對照組滑膜組織規則，幾乎無炎癥細胞浸潤；模型組滑膜細胞大量增生，滑膜組織紊亂并伴有大量炎癥細胞浸潤聚集，組織周邊可見缺損；吲哚美辛組滑膜組織細胞排列相對整齊，炎癥細胞浸潤較少；仙方活命飲低、中、高劑量組滑膜組織細胞排列逐漸整齊，炎癥細胞浸潤椎間減少，且高劑量組與吲哚美辛組相近。

2.5 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白表達比較 見表4。

表2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

表2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與仙方活命飲低劑量組相比，cP＜0.05；與仙方活命飲中劑量組相比，dP＜0.05。

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表3 各組氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6水平比較（ng/L，-x±s））

表4 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與仙方活命飲低劑量組相比，cP＜0.05；與仙方活命飲中劑量組相比，dP＜0.05。

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3 討論

滑膜炎不僅導致滑膜組織受損，引起分泌液失調形成積液，加大關節承受壓力；同時炎癥因子刺激軟骨，嚴重影響關節的正常功能，給患者帶來痛苦。本研究結果顯示，滑膜炎大鼠滑膜組織嚴重增生、結構紊亂并伴有大量炎癥細胞浸潤聚集，表明滑膜炎大鼠的滑膜組織存在嚴重損傷；氣囊灌洗液中SOD、GSH 含量顯著降低，滲出液量顯著升高，灌洗液中白細胞數量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平顯著升高，表明滑膜炎大鼠體內炎癥因子水平嚴重增加，導致上述病理改變。

中醫認為，滑膜炎的主要病機是氣血痹阻不通，筋脈關節失于濡養所致。抑制炎癥因子產生能夠改善動物模型中滑膜炎大鼠關節疼痛及炎癥反應［7］。目前，采用中醫辨證治療滑膜炎已取得顯著成果。趙澤軍等［8］報道，板藍根可降低氣囊滑膜炎滲出液中MDA 含量，提高血清SOD 水平，進而減輕氧化應激反應，減少中性粒細胞浸潤，降低TNF-α等促炎介質水平，具有明顯的抗炎、抗氧化和免疫調節作用。YANG 等［9］報道，白藜蘆醇可降低滑膜炎大鼠血清MDA 含量，提高SOD 活性，具有較強的鎮痛和抗炎、抗氧化活性。方婷婷［10］報道，仙方活命飲加減輔助布洛芬口服液治療能提高小兒髖關節滑膜炎的臨床療效，降低髖關節疼痛評分。本研究結果顯示，與模型組相比，仙方活命飲低、中、高劑量組背部灌洗液中SOD 和GSH 含量依次升高，滑膜組織中炎癥細胞浸潤逐漸緩解；大鼠氣囊滲出液量、灌洗液中白細胞數量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 含量依次降低，提示仙方活命飲對滑膜炎大鼠有積極的治療作用。

NLRP3/Caspase-1通路是炎癥反應的關鍵通路，NLRP3 抑制劑和Caspase-1 抑制劑均可降低促炎因子含量［11］。研究顯示，抑制NLRP3/Caspase-1 信號通路能夠抑制小鼠內質網的氧化應激反應，改善缺血再灌注引起的心肌功能障礙［12］；下調NLRP3 表達可顯著減弱異氟醚對NLRP3 炎癥小體的激活，減少細胞中IL-18、IL-1 分泌［13］。SUN 等［14］報道，異丙酚可通過NLRP3 炎癥小體直接誘導Caspase-1 依賴的巨噬細胞焦亡。WANG 等［15］報道，豆蔻素可通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活，下調結腸炎小鼠結腸中IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 水平，改善小鼠結腸炎。本研究結果顯示，與模型組相比，仙方活命飲低、中、高劑量組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 蛋白表達量依次降低，呈劑量依賴性，提示仙方活命飲可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路，降低炎癥因子TNF-α 和IL-6 表達，緩解滑膜炎大鼠滑膜組織損傷，減少背部滲出液。

綜上所述，仙方活命飲可降低炎癥因子表達，抑制氧化應激反應，緩解滑膜炎大鼠滑膜組織損傷，減少背部滲出液；其機制可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號通路相關，為臨床上使用仙方活命飲治療滑膜炎提供了理論依據。